プロテインホスファタ-ゼの活性制御に関する基礎的研究

蛋白磷酸酶活性调控的基础研究

基本信息

批准号：
02670109
负责人：
武田誠郎
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1990
资助国家：
日本
起止时间：
1990 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

プロテインホスファタ-ゼは蛋白性インヒビタ-により阻害されるタイプ1,されないタイプ2A,2B,2Cに分類される。この内2Aの活性調節機構はまだ明らかでない。我々はヒト赤血球細胞質可溶画分に2Aに属する基質特異性の異なるホスファタ-ゼI(Mr=180,000),III(Mr=177,000),IV(Mr=104,000)を見い出し、これらを均質に精製した。サブユニット構造はIがα_1β_1δ_1,IIIがα_1β_1γ_1,IVがα_1β_1と推定された。SDSーPAGEで算出した分子質量はαが34kDa,βが63kDa,γが53kDa,δが74kDaである。αが触媒サブユニットでβ,γ,δは調節サブユニットとして各酵素に固有の基質特異性,2価金属イオン要求性を与える。ホスファタ-ゼI,III,IVをMg^<2+>,ATP共存下に,サイクリックAMP依存性プロテインキナ-ゼ(Aーキナ-ゼ),Ca^<2+>リン脂質依存性プロテインキナ-ゼ(Cーキナ-ゼ),Ca^<2+>ーカルモジュリン依存性プロテインキナ-ゼII,ホスホリラ-ゼキナ-ゼ,ミオシン軽鎖キナ-ゼ,カゼインキナ-ゼIとそれぞれインキュベ-トすると,ホスファタ-ゼIのδサブユニットの特定のセリン残基のみが定量的にAーキナ-ゼとCーキナ-ゼによってリン酸化された。他のプロテインキナ-ゼはいづれのサブユニットもリン酸化しない。Aーキナ-ゼまたは、Cーキナ-ゼのホスファタ-ゼIに対するKm値は0.2〜0.3μMで赤血球内ホスファタ-ゼIの推定濃度とほぼ等しい。トリプシン消化リン酸化ペプチドの比較より、両酵素に共通のリン酸化部位とCーキナ-ゼに特有なリン酸化部位の存在が認められた。両酵素によりδサブユニットのリン酸化により、リン酸化H1ヒストンに対する脱リン酸化活性は20ー40%上昇した。一方、リン酸化ミオシン軽鎖に対する脱リン酸化活性はCーキナ-ゼによるリン酸化で50%促進を受け、Aーキナ-ゼのリン酸化で20%抑制された。異なるキナ-ゼによるδのリン酸が、異なる活性制御を行うことが示唆された。

将蛋白质磷酸酶分为1型和2A型，2B和2C，这些蛋白抑制剂抑制蛋白抑制剂。其中，调节2a活性的机制尚不清楚。我们发现磷酸酶I（MR = 180,000），III（MR = 177,000）和IV（MR = 104,000），在人类红细胞细胞质可溶性馏分中属于2a的底物特异性不同，并同时纯化它们。亚基结构估计为α_1β_1Δ_1，III和IV为α_1β_1。通过SDS-PAGE计算的分子质量为34KDA，β为63kDa，γ为53kDa，δ为74KDA。 α是催化亚基和β，γ和δ，因为调节亚基为每种酶提供了内在的底物特异性和二价金属离子需求。当将磷酸酶I，III和IV与环状AMP依赖性AMP蛋白激酶（A-激酶）一起孵育时，Ca^<2+>>>>>>>>>>>磷脂依赖性蛋白激酶（C-激酶），Ca^<2+>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>磷酸酶I的δ亚基被A-激酶和C-激酶定量磷酸化。其他蛋白激酶不会磷酸化任何亚基。 A-激酶或C-激酶磷酸酶I的KM值为0.2-0.3μM，大约等于促炎细胞磷酸酶的估计浓度I.胰蛋白酶消化磷酸化肽的比较表明，这两种酶都表明，这两种酶均具有常见的磷酸化位点和磷酸化位点，而磷酸化位点独特。两种酶对δ亚基的磷酸化增加了磷酸化的H1组蛋白的去磷酸化活性增加了20-40％。另一方面，C-激酶通过磷酸化50％促进了针对磷酸化的肌球蛋白轻链的去磷酸化活性，而A型激酶的磷酸化为20％。有人提出，不同的Quinase通过不同的活性控制δ磷酸盐。