プロテインホスファタ-ゼの活性制御に関する基礎的研究

蛋白磷酸酶活性调控的基础研究

基本信息

批准号：
02670109
负责人：
武田誠郎
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1990
资助国家：
日本
起止时间：
1990 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

プロテインホスファタ-ゼは蛋白性インヒビタ-により阻害されるタイプ1,されないタイプ2A,2B,2Cに分類される。この内2Aの活性調節機構はまだ明らかでない。我々はヒト赤血球細胞質可溶画分に2Aに属する基質特異性の異なるホスファタ-ゼI(Mr=180,000),III(Mr=177,000),IV(Mr=104,000)を見い出し、これらを均質に精製した。サブユニット構造はIがα_1β_1δ_1,IIIがα_1β_1γ_1,IVがα_1β_1と推定された。SDSーPAGEで算出した分子質量はαが34kDa,βが63kDa,γが53kDa,δが74kDaである。αが触媒サブユニットでβ,γ,δは調節サブユニットとして各酵素に固有の基質特異性,2価金属イオン要求性を与える。ホスファタ-ゼI,III,IVをMg^<2+>,ATP共存下に,サイクリックAMP依存性プロテインキナ-ゼ(Aーキナ-ゼ),Ca^<2+>リン脂質依存性プロテインキナ-ゼ(Cーキナ-ゼ),Ca^<2+>ーカルモジュリン依存性プロテインキナ-ゼII,ホスホリラ-ゼキナ-ゼ,ミオシン軽鎖キナ-ゼ,カゼインキナ-ゼIとそれぞれインキュベ-トすると,ホスファタ-ゼIのδサブユニットの特定のセリン残基のみが定量的にAーキナ-ゼとCーキナ-ゼによってリン酸化された。他のプロテインキナ-ゼはいづれのサブユニットもリン酸化しない。Aーキナ-ゼまたは、Cーキナ-ゼのホスファタ-ゼIに対するKm値は0.2〜0.3μMで赤血球内ホスファタ-ゼIの推定濃度とほぼ等しい。トリプシン消化リン酸化ペプチドの比較より、両酵素に共通のリン酸化部位とCーキナ-ゼに特有なリン酸化部位の存在が認められた。両酵素によりδサブユニットのリン酸化により、リン酸化H1ヒストンに対する脱リン酸化活性は20ー40%上昇した。一方、リン酸化ミオシン軽鎖に対する脱リン酸化活性はCーキナ-ゼによるリン酸化で50%促進を受け、Aーキナ-ゼのリン酸化で20%抑制された。異なるキナ-ゼによるδのリン酸が、異なる活性制御を行うことが示唆された。

蛋白磷酸酶分为 1 型（受蛋白抑制剂抑制）和 2A、2B 和 2C 型（不受蛋白抑制剂抑制）。调节2A活性的机制尚不清楚。我们在人红细胞胞质的可溶部分中发现了属于2A的具有不同底物特异性的磷酸酶I（Mr=180,000）、III（Mr=177,000）和IV（Mr=104,000），并将它们纯化至均质。 I 的亚基结构估计为 α_1β_1δ_1，III 的亚基结构为 α_1β_1γ_1，IV 的亚基结构为 α_1β_1。通过 SDS-PAGE 计算的分子量为 α 为 34 kDa、β 为 63 kDa、γ 为 53 kDa、δ 为 74 kDa。 α 是催化亚基，β、γ 和 δ 是调节亚基，赋予每种酶独特的底物特异性和对二价金属离子的需求。 Mg^2+ 和 ATP 存在下的磷酸酶 I、III、IV、环 AMP 依赖性蛋白激酶（A-激酶）、Ca^2+ 磷脂依赖性蛋白激酶 Ca^2+-钙调蛋白依赖蛋白当与天激酶 II、磷酸化酶、肌球蛋白轻链激酶和酪蛋白激酶 I 一起孵育时，仅磷酸酶 I δ 亚基的特定丝氨酸残基定量显示 A 激酶和 C 激酶孵育。其他蛋白激酶不会磷酸化任一亚基。 A-激酶或C-激酶对磷酸酶I的Km值为0.2至0.3μM，大约等于红细胞中磷酸酶I的估计浓度。胰蛋白酶消化的磷酸肽的比较揭示了两种酶共有的磷酸化位点和C-激酶独有的磷酸化位点的存在。两种酶对 δ 亚基的磷酸化使针对磷酸化 H1 组蛋白的去磷酸化活性增加了 20-40%。另一方面，磷酸化肌球蛋白轻链的去磷酸化活性被C-激酶磷酸化促进50%，并被A-激酶磷酸化抑制20%。有人认为，不同激酶对 δ 的磷酸化以不同方式调节其活性。