プロテインホスファターゼ2Aの活性制御に関する研究

蛋白磷酸酶2A活性调控研究

基本信息

批准号：
09877026
负责人：
武田誠郎
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

1) B"の試験管内リン酸化部位の決定(武田分担)-ヒト赤血球サイトゾル画分よりPP2A(ACB")を当教室で確立した方法で均質に精製した。精製酵素を試験管内でオカダ酸の存在下,[γ-32P]ATPを用いてA-キナーゼでリン酸化した。リン酸化B"をSDS-PAGEで他のサブユニット,酵素より分離し,リジンエンドペプチダーゼで消化後,リン酸化消化ペプチドをC^<18>逆相カラムで分離し,そのアミノ酸配列を決定した。B"の推定一次構造よりB"のリン酸化部位をSer-60,Ser-75,Ser-573と決定した。2) B"のリン酸化による活性変化の解析(碓井分担)-精製したACB"を150mM KCl存在下でATPを用いてA-キナーゼでリン酸化し,A-キナーゼでリン酸化したH1ヒストン,H2Bヒストン,ホスホリラーゼを基質として,リン酸化による活性変化を解析した。その結果,B"のリン酸化により,これらの基質に対する特異性の変化が見られた。3) B"結合蛋白質の検索(西藤分担)-B"とGAL4タンパク質のDNA結合ドメインとの融合タンパク質を発現するプラスミドを出芽酵母Y190に導入する。これにGAL4タンパク質の転写活性化ドメインとの融合タンパク質を発現するヒト大脳cDNAライブラリーを導入し,レポーター遺伝子HIS3の発現を指標にスクリーニングを行い,B"と結合するタンパク質のcDNAを単離し,解析中である。4) 分裂酵母のB"に対応する遺伝子破壊株の作成と解析(田邉分担)-分裂酵母のB"ホモログであるpbpl^+とpbp2^+の2つの遺伝子をPCRにより単離し,選択マーカーのura4^+遺伝子を挿入した後,分裂酵母のura4^-変異株に導入しpbpl^+とpbp2^+遺伝子破壊株を作成した。この遺伝子破壊株には形態,増殖能に異常が見られ,ヒトB"遺伝子の導入によりこの異常は救済された。

1）使用在我们教室中建立的方法，从人类红细胞胞质分数均质地纯化了B“（Takeda）-PP2A（ACB”）的体外磷酸化位点。在存在冈田酸的情况下，使用[γ-32p] ATP在体外用A-激酶在体外磷酸化酶。通过SDS-PAGE将磷酸化的B与其他亚基和酶分离，用赖氨酸内肽酶消化，然后将磷酸化的肽分离在C^<18>反向的相柱上，以确定其氨基酸序列，以确定B的磷酸化位点。Ser-60，Ser-575，Ser-575，Ser-573，ser-573333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333。 Ser-75，Ser-573。结果，B的磷酸化显示了这些底物的特异性变化。3）质粒在B“ seito分支蛋白（Nishito Branching）-b之间表达融合蛋白的质粒-b”和GAL4蛋白的DNA结合结构域的DNA蛋白质蛋白的DNA结合结构蛋白介绍了糖类Y190的固定蛋白蛋白质的froteiniation forniation fornial formbral formbral fortion forsiation。引入了与B结合的蛋白质的cDNA。它们进入裂变酵母的URA4^释放菌株，以创建PBPL^+和PBP2^+基因破坏菌株。基因破坏菌株在形态和增殖方面表现出异常，并且通过引入人类B“基因来挽救这种异常。