プロテインホスファターゼ2Aの活性制御に関する研究

蛋白磷酸酶2A活性调控研究

基本信息

批准号：
09877026
负责人：
武田誠郎
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

1) B"の試験管内リン酸化部位の決定(武田分担)-ヒト赤血球サイトゾル画分よりPP2A(ACB")を当教室で確立した方法で均質に精製した。精製酵素を試験管内でオカダ酸の存在下,[γ-32P]ATPを用いてA-キナーゼでリン酸化した。リン酸化B"をSDS-PAGEで他のサブユニット,酵素より分離し,リジンエンドペプチダーゼで消化後,リン酸化消化ペプチドをC^<18>逆相カラムで分離し,そのアミノ酸配列を決定した。B"の推定一次構造よりB"のリン酸化部位をSer-60,Ser-75,Ser-573と決定した。2) B"のリン酸化による活性変化の解析(碓井分担)-精製したACB"を150mM KCl存在下でATPを用いてA-キナーゼでリン酸化し,A-キナーゼでリン酸化したH1ヒストン,H2Bヒストン,ホスホリラーゼを基質として,リン酸化による活性変化を解析した。その結果,B"のリン酸化により,これらの基質に対する特異性の変化が見られた。3) B"結合蛋白質の検索(西藤分担)-B"とGAL4タンパク質のDNA結合ドメインとの融合タンパク質を発現するプラスミドを出芽酵母Y190に導入する。これにGAL4タンパク質の転写活性化ドメインとの融合タンパク質を発現するヒト大脳cDNAライブラリーを導入し,レポーター遺伝子HIS3の発現を指標にスクリーニングを行い,B"と結合するタンパク質のcDNAを単離し,解析中である。4) 分裂酵母のB"に対応する遺伝子破壊株の作成と解析(田邉分担)-分裂酵母のB"ホモログであるpbpl^+とpbp2^+の2つの遺伝子をPCRにより単離し,選択マーカーのura4^+遺伝子を挿入した後,分裂酵母のura4^-変異株に導入しpbpl^+とpbp2^+遺伝子破壊株を作成した。この遺伝子破壊株には形態,増殖能に異常が見られ,ヒトB"遺伝子の導入によりこの異常は救済された。

1) B" 体外磷酸化位点的测定（武田的贡献） - 使用我们实验室建立的方法从人红细胞胞质级分中纯化 PP2A (ACB") 至同质。在体外，在冈田酸存在的情况下，使用 [γ-32P]ATP 将纯化的酶用 A-激酶磷酸化。通过SDS-PAGE将磷酸化的B''与其他亚基和酶分离，用赖氨酸内肽酶消化，并使用C^ 18 反相柱分离磷酸化的消化肽，并确定其氨基酸序列。根据B"的估计一级结构，确定B"的磷酸化位点为Ser-60、Ser-75和Ser-573。分析由于 B" 磷酸化引起的活性变化（臼井） - 纯化的 ACB" 在 150mM KCl 存在下使用 ATP 用 A-激酶磷酸化，H1 组蛋白、H2B 组蛋白用 A-激酶磷酸化，使用磷酸化酶作为底物，我们分析了磷酸化引起的活性变化。结果，由于 B'' 的磷酸化，观察到这些底物特异性的变化。 3)将表达B“结合蛋白搜索(Saito)-B”和GAL4蛋白的DNA结合结构域的融合蛋白的质粒导入酿酒酵母Y190中。将表达具有GAL4蛋白转录激活结构域的融合蛋白的人脑cDNA文库导入其中，以报告基因HIS3的表达为指标进行筛选。与B"结合的蛋白的cDNA为隔离并分析 4)裂殖酵母中与 B" 相对应的基因破坏菌株的创建和分析（田边的份额） - 通过 PCR 分离了两个基因 pbpl^+ 和 pbp2^+，它们是裂殖酵母中 B" 的同源物，并选择标记ura4^ +插入基因之后，将它们引入裂殖酵母的ura4^-突变株中，以产生pbpl^+和pbp2^+基因破坏菌株，在这些基因破坏菌株中观察到形态和生长能力的异常，而人类B"。这一异常现象得到了纠正。