プロテインキナーゼCによるチロシンキナーゼの燐酸化さその活性制御に関する研究

蛋白激酶C调控酪氨酸激酶磷酸化活性的研究

基本信息

批准号：
63641522
负责人：
武田誠郎
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1988
资助国家：
日本
起止时间：
1988 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

プロテインキナーゼCの精製はラット脳シトゾルよりDE-52、トレオニン-セファローズ、TSKgelPhenyl-5PW、TSKgelG3000SWを用いて電気泳動的に均質に精製した。プロテインキナーゼCの生理的基質の一つと考えられる原癌遺伝子c-srcの産物には従来種々の組織に見い出されているpp60^<c-src>とそのN端末側に6つのアミノ酸の挿入された、神経細胞にのみ見い出されているpp60^<c-src+>とがある。プロテインキナーゼCによるこれら2種のpp60^<c-src>のリン酸化反応を検索する目的で、ラット脳顆粒画分よりこれらを分離精製した。チロシンキナーゼ活性は、Tyr-Glu(1:4)ポリマーを基質として測定した。チロシンキナーゼを顆粒画分より2%Nonidet P-40-0.5M Naclを含む緩衝液で定量的に可溶化し、SephacrylS-300のゲル濾過、レクチンアガロース処理後、casein-Toyopearlのカラムクロマトで5つの活性ピーク(酵素1-5)に分離した。この内、酵素3及び4がc-src産物に特異的に反応する単クローン抗体(MAb327)と免疫沈降した。酵素3と4は同じカラムの再クロマトで完全に分離された。酵素3と4の比活性は685unit/mg、1850unit/mgで顆粒画分よりそれぞれ6.4倍、17倍精製された。更にアンフォライン等電点電気泳動カラムで酵素3と4はそれぞれ純度5%、25%に精製され、両者の等電点はいずれも6.6であった。酵素3と4の自己リン酸化バンドはSDS-PAGEでそれぞれ60kDa及び61kDaを示し、A-キナーゼリン酸化した後のV8プロテアーゼによる消化ペプチドマップから酵素3がpp60^<c-src>、酵素4がpp60^<c-src+>と推定された。pp60^<c-src>とpp60^<c-src+>をそれぞれ精製したプロテインキナーゼCでリン酸化し、SDS-PAGEによるV8プロテアーゼによる消化ペプチドマップにより分析すると、両者はN末側34kDaにリン酸化部位があることがわかった。リン酸化部位の決定、リン酸化による活性変化の解析を計画している。

使用 DE-52、苏氨酸-Sepharose、TSKgel Phenyl-5PW 和 TSKgel G3000SW 将大鼠脑细胞质中的蛋白激酶 C 纯化至均质。原癌基因c-src的产物被认为是蛋白激酶C的生理底物之一，含有已在多种组织中发现的pp60^<c-src>，其插入有6个氨基酸。另外，还有pp60^<c-src+>，仅存在于神经细胞中。为了研究蛋白激酶C对这两类pp60^<c-src>的磷酸化，从大鼠脑颗粒级分中分离纯化了它们。使用 Tyr-Glu(1:4) 聚合物作为底物测量酪氨酸激酶活性。用含有2％Nonidet P-40-0.5M NaCl的缓冲液从颗粒级分中定量溶解酪氨酸激酶，进行Sephacryl S-300凝胶过滤、凝集素琼脂糖处理和酪蛋白-Toyopearl柱色谱分离成活性峰。（酶1-5）。其中，酶 3 和 4 使用与 c-src 产物特异性反应的单克隆抗体 (MAb327) 进行免疫沉淀。酶3和4在同一柱上通过重色谱完全分离。酶3和4的比活性分别为685单位/mg和1850单位/mg，分别是从颗粒级分中纯化的6.4倍和17倍。此外，酶3和酶4利用安佛林等电聚焦柱分别纯化至纯度5%和25%，等电点均为6.6。酶3和4的自磷酸化条带在SDS-PAGE上分别显示60kDa和61kDa，用V8蛋白酶消化后酶3和4的肽图分别显示pp60^<c-src>和酶4估计为。为 pp60^<c-src+>。当 pp60^<c-src> 和 pp60^<c-src+> 分别用纯化的蛋白激酶 C 磷酸化并使用 SDS-PAGE 用 V8 蛋白酶消化的肽图进行分析时，两者都被磷酸化至 N 末端 34kDa I。发现还有零件。我们计划确定磷酸化位点并分析磷酸化引起的活性变化。