プロテインキナーゼCによるチロシンキナーゼの燐酸化さその活性制御に関する研究

蛋白激酶C调控酪氨酸激酶磷酸化活性的研究

基本信息

批准号：
63641522
负责人：
武田誠郎
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1988
资助国家：
日本
起止时间：
1988 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

プロテインキナーゼCの精製はラット脳シトゾルよりDE-52、トレオニン-セファローズ、TSKgelPhenyl-5PW、TSKgelG3000SWを用いて電気泳動的に均質に精製した。プロテインキナーゼCの生理的基質の一つと考えられる原癌遺伝子c-srcの産物には従来種々の組織に見い出されているpp60^<c-src>とそのN端末側に6つのアミノ酸の挿入された、神経細胞にのみ見い出されているpp60^<c-src+>とがある。プロテインキナーゼCによるこれら2種のpp60^<c-src>のリン酸化反応を検索する目的で、ラット脳顆粒画分よりこれらを分離精製した。チロシンキナーゼ活性は、Tyr-Glu(1:4)ポリマーを基質として測定した。チロシンキナーゼを顆粒画分より2%Nonidet P-40-0.5M Naclを含む緩衝液で定量的に可溶化し、SephacrylS-300のゲル濾過、レクチンアガロース処理後、casein-Toyopearlのカラムクロマトで5つの活性ピーク(酵素1-5)に分離した。この内、酵素3及び4がc-src産物に特異的に反応する単クローン抗体(MAb327)と免疫沈降した。酵素3と4は同じカラムの再クロマトで完全に分離された。酵素3と4の比活性は685unit/mg、1850unit/mgで顆粒画分よりそれぞれ6.4倍、17倍精製された。更にアンフォライン等電点電気泳動カラムで酵素3と4はそれぞれ純度5%、25%に精製され、両者の等電点はいずれも6.6であった。酵素3と4の自己リン酸化バンドはSDS-PAGEでそれぞれ60kDa及び61kDaを示し、A-キナーゼリン酸化した後のV8プロテアーゼによる消化ペプチドマップから酵素3がpp60^<c-src>、酵素4がpp60^<c-src+>と推定された。pp60^<c-src>とpp60^<c-src+>をそれぞれ精製したプロテインキナーゼCでリン酸化し、SDS-PAGEによるV8プロテアーゼによる消化ペプチドマップにより分析すると、両者はN末側34kDaにリン酸化部位があることがわかった。リン酸化部位の決定、リン酸化による活性変化の解析を計画している。

使用DE-52，苏氨酸 - 塞弗罗斯，tskgelphenyl-5pw和Tskgelg3000SW从大鼠脑细胞质中对蛋白激酶C的纯化进行电泳纯化。原始癌基因C-SRC的产物被认为是蛋白激酶C的生理底物之一，包括以前在各种组织中发现的PP60^<c-SRC>，并且仅在神经元中发现了pp60^<c-SRC+>，该神经元仅在六个氨基酸sentrimal n dimnical n dimnical in n emniminal in n ersins中。为了通过蛋白激酶C搜索这两个PP60^<c-Src> s的磷酸化反应，将它们分离并从大鼠脑颗粒级分中纯化。使用Tyr-Glu（1：4）聚合物作为底物确定酪氨酸激酶活性。将酪氨酸激酶定量地从含有2％非IDET P-40-0.5M NaCl的缓冲液中定量溶解，并在凝胶过滤Sephacryls-300并用凝集素琼脂糖处理后，将酪氨酸分离为五个活性峰（enzymes 1-5）casisIn collawt collawts insin-tomin-toyopopopopyllllll collawts collawts collawts collawt。其中，用特别反应于C-SRC产物反应的单克隆抗体（MAB327）免疫沉淀酶。酶3和4通过同一色谱柱上的再染色仪完全分离。酶3和4的特定活性分别以685单位/mg和1850单位/mg纯化，分别为颗粒分数的6.4和17倍。此外，酶3和4纯度纯化至5％和25％的纯度，在同载等电聚焦柱上纯度，并且两者均纯化为6.6。酶3和4的自磷酸化条带分别在SDS-PAGE上显示60 kDa和61 kDa，估计酶3为PP60^<c-Src>，酶4为PP60^<c-Src+>，来自V8蛋白酶的imake potsease a-profate a-aperape a-profate pp60^<c-src>。当Pp60^<c-Src>和PP60^<c-Src+>用纯化的蛋白激酶C磷酸化，并使用SDS-PAGE使用V8蛋白酶的消化肽图对磷酸化，并使用SDS-PAGE进行分析时，都发现两者在N端34KDA的N-末端磷酸化位点都有一个磷酸化位点。我们计划确定磷酸化位点，并分析由磷酸化引起的活动变化。