ヒト細胞遺伝子のノックアウトの高効率化のための萌芽的研究

人类细胞基因高效敲除的探索性研究

基本信息

批准号：
18657053
负责人：
関政幸
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18657053/
关键词：
相同組換え Ino80 Arp4 Arp6 Swr1 Rad52 NHEJ CAF-1 ChIP 出芽酵母標的組換えヒストン

项目摘要

1)出芽酵母Arp6は組換えの抑制に関わる;Swr1複合体のサブユニットarp6変異株で組換えが亢進することを論文発表した(Kawashima et al.,2007)。2)出芽酵母を用いた、相同組換えのクロマチンレベルでの抑制機構の解明;sgs1変異株において相同組換えの亢進(swr1株よりも亢進の程度は低い)が観察される。ここで、swr1-sgs1二重変異株を作製して、今までに報告のない高い頻度の組換えが起るかどうかを調べたが、予想に反してそうはならなかった。一方、複製にカップルしてヌクレオソームの形成に関わるCAF-1とSgs1の同時欠損において、相乗的な姉妹染色分体間の組換えの亢進を見いだした。3)ヒトNalm6細胞を用いた、高効率の遺伝子破壊法の確立;ヒトNalm6細胞はB細胞由来の細胞株で、比較的標的遺伝子の破壊の効率が良い細胞として知られ、既に幾つかの遺伝子破壊株の作製とその解析が報告されている。そこでSWR1とBLMの両遺伝子の発現を同時に抑制させるsiRNAをNalm6細胞に導入し、その条件下で標的遺伝子の破壊効率の測定を行う予定だったが、出芽酵母swr1-sgs1株でhyper-recombinationの表現型が観察されなかったため中断した。その代わりニワトリDT40細胞でCAF1およびBLMのノックアウト細胞が確立しているのを利用し、DT40 BLM-CAF1二重遺伝子破壊株を作製している。この株を用いて、標的遺伝子破壊の上昇を確かめ、その後Nalm6系への応用を想定して実験を進めている。

1）牙龈酵母ARP6与重组的控制有关； SWR1复合物的亚基ARP6突变体增强了重组（Kawashima等，2007）。 2）在SGS1突变量中观察到使用饺子酵母在同源重组的染色质水平上阐明抑制性机制（增强程度低于SWR1菌株）。在这里，我们制作了SWR1-SGS1双变量股票，并检查了到目前为止是否无法报告高频重组，但这并没有违反预期。另一方面，在与核小体形成的CAF-1和SGS1的同时缺陷中，我们发现了协同姐妹染色体体的增强。 3）使用人NALM6细胞建立高效率基因破坏方法；靶向基因的破坏。因此，将同时抑制SWR1和BLM表达的siRNA引入了NALM6细胞中，在条件下，我们计划测量靶基因的破坏效率，但在Bud Yeast Yeast Swr1-SGS1共享中进行了超续录。它被中断，因为未观察到表达类型。取而代之的是，使用鸡DT40细胞中的CAF1和BLM敲除细胞产生DT40 BLM-CAF1双基因破坏量。使用这种菌株，我们已经确认了靶向基因破坏的增加，然后在预期NALM6系列的应用中进行实验。