全真核細胞に適用可能な新規遺伝子破壊法の開発

开发适用于所有真核细胞的新基因破坏方法

基本信息

批准号：
14658220
负责人：
関政幸
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14658220/
关键词：
Xenopus Eggs Extract RAD51 RAD54 RECQL4 BRC4 ノックアウト RPA

项目摘要

本研究では、試験管内で様々に加工した二本鎖DNA/組換えタンパク質RAD51を調製し、それを核の標的遺伝子座にターゲットインテグレーションさせる新規遺伝子破壊法の確立を目指した。実際には、カエル精子をカエル卵抽出液中で反応させて構築した核を標的として、全ての反応を試験管内で完結できるようにした。残念ながらRAD51の調製に難航し、最終的なジーシターゲッティングの成功までには至らなかったが、試験管内で以下の相同組換え反応を再現できた。1)反応系にEcoRIを加えて精子DNAに二重鎖切断(DSB)を導入したところ、RPAが集積し、さらにはRAD51が精子核にリクルートされた。2)さらにRAD51が集積した近辺でgemininに耐性のDNA合成、すなわちDNA修復合成活性を見いだした(J.Cell.Sci.,2002)。3)ここで抽出液からRPAを除去すると、EcoRIで形成されたDSBにRAD51がリクルートされないことを証明した。4)一方RAD51の反応をBRC4を添加して阻害すると、EcoRI誘導のRAD51のクロマチンへの結合が阻害された。この条件下でRPAのクロマチンへの結合はBRC4の有り無しで影響を受けないが、ヒト早老症ロスムンドートムソン症候群原因産物RECQL4のEcoRIで誘導されるクロマチン結合は有意に減少した。逆にRECQL4を反応液から枯渇させるとEcoRI誘導RAD51のクロマチンへの結合速度が遅れた。5)さらにRECQL4の枯渇とBRC4添加によるRAD51の阻害をいっぺんに行うとEcoRIによって生じたDSBのDNA修復合成に必要と考えられるDNAポリメラーゼαのクロマチンへの結合が消失した。以上の本研究を通じ、カエル卵抽出液中で相同組換え反応を解析できることを立証し、ジーンターゲッティングを試験管内で再構成するための実験系を提示できた。

在这项研究中，我们旨在建立一种新的基因破坏方法，该方法制备了双链DNA/重组蛋白RAD51，该方法以各种方式进行处理，并将其靶向为核靶基因座。实际上，所有反应都可以在试管中完成，以针对通过在青蛙蛋提取物中反应青蛙精子建造的细胞核。不幸的是，Rad51的制备很困难，并且没有达到Zeschargeting的最终成功，但是在试管中重现了以下局部重组反应。 1）当将ECORI系统添加到反应系统中时，将重复切割（DSB）引入精子DNA，累积RPA，然后将RAD51募集到精子核。 2）此外，我们发现在RAD51积累的区域，即DNA修复合成的区域中，DNA合成具有耐药性（J.Cell.Sci。，2002）。 3）证明，当从提取物中取出RPA时，RAD51不会募集到ECORI形成的DSB。 4）另一方面，当通过添加BRC4添加RAD51反应时，抑制了ECORI诱导的RAD51的结合。在这些条件下，RPA的染色质的结合不受BRC4的存在或不存在的影响，而是由人类快速衰老的玫瑰花症综合征诱导的染色质键显着降低。相反，当RECQL4从反应溶液中耗尽时，ECORI诱导的RAD51与染色质的结合速度延迟。 5）此外，当RECQL4耗尽并因添加BRC4而引起的RAD51抑制时，已丢失了与DNA聚合酶α的结合，这被认为是ECORI生成的DSB的DNA修复合成所必需的。通过这项研究，证明可以在青蛙提取物中分析局部反应，并提出了一个实验系统以重建试管中的Jean靶向。