ヒト細胞の遺伝子のノツクアウトの高効率化への挑戦的研究

提高人类细胞基因敲除效率的挑战性研究

基本信息

批准号：
21657042
负责人：
関政幸
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

真核細胞のDNAは、H2A-H2B二量体とひとつのヒストン(H3-H4)_2四量体からなるヒストン八量体に巻き付き、ヌクレオソーム構造をとる。ヌクレオソーム構造は相同組換え反応を含めた様々なDNA介在反応を負に制御している。従って、相同組換えを利用した遺伝子のノックアウトの高率化において、組換え反応時のヌクレオソームの制御機構を理解し、その原理をノックアウトの高率化に応用することは重要である。申請者は、昨年度の実績としてヒストンのアミノ酸を個々にアラニンに置換した酵母の点突然変異株ライブラリー439株の解析を行ない、相同組換えに欠損がありそうな90株のMMS感受性点変異株を同定していた(Genes Cells 14,1271-1330,2009)。この中から、MMS感受性を示す、H3-K56A変異株に焦点あてた。H3-K56はアセチル化(H3-K56-Ac)されることが知られていたが、本研究でH3-K56-Acに依存して、相同組換えの一種である姉妹染色分体間の組換え(SCR)が起ることをはじめて見いだした(GEnes Cells 15,945-958,2010)。興味深いことに、DNAヘリカーゼSgslの欠損あるいはヒストンシャペロンCAF-1の欠損により、それぞれSCRが野生株に比べて亢進することを見いだした。さらにCAF-1とSgslの同時欠損酵母細胞ではSCRが相乗的に頻発した。これは、ヒト細胞でCAF-1とSgslの相同遺伝子を同時に低下させることで、ヒト細胞に高効率のノックアウトを実現できる可能性を示したものといえる。

本地细胞的DNA围绕组成的八体缠绕，由H2A-H2B双体和一个组蛋白（H3-H4）_2四量子，并具有一个核众的结构。核小体结构由各种DNA中间反应（包括局部重组反应）控制。因此，重要的是要在重组反应时了解核小体控制机制，并使用同质重组的基因敲除率最高的敲除率将原理应用于最高的敲除率。申请人分析了酵母的439股，该股份已被丙氨酸代替，作为去年的往绩记录，以及90 mms敏感的点突变股份可能被鉴定出来（基因细胞14，，14，，基因）。 1271-1330,2009）。由此，我们集中在显示MMS敏感性的H3-K56A突变体上。尽管已知H3-K56是乙酰化（H3-K56-AC），但这项研究取决于H3-K56-AC，并且是姐妹染色体之间的一组，这是一种同源重组。（SCR）会发生（基因细胞15,945-958,2010）。有趣的是，我们发现，由于DNA解旋酶SGSL或Histon Chaperon CAF-1的缺陷，SCR与野生菌株相比得到了增强。另外，SCR经常发生在CAF-1和SGSL之间的酵母菌细胞中。这表明人类细胞可以通过减少CAF-1和SGSL之间的相基因来实现高效敲除。