哺乳類細胞のDNA複製に関与するDNAヘリカーゼBの解析

哺乳动物细胞 DNA 复制中 DNA 解旋酶 B 的分析

基本信息

批准号：
09780619
负责人：
関政幸
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09780619/
关键词：
DNA複製 DNAヘリカーゼB PCNA 温度感受性変異株 Replication Foci

项目摘要

マウス温度感受性変異株tsFT848細胞は、非許容温度でDNA複製低下及びDNAヘリカーゼB活性の低下が観察される。初年度ではヘリカーゼBがtsFT848細胞の温度感受性の真の原因遺伝子か決定する実験を行い、直接の原因であることをほぼ確定できた。本年度は、ヘリカーゼBがいつ・どこで・誰とDNA複製に関与するか特定することを試みた。1) WHEN:DNAヘリカーゼBに対する抗体とReplication Forkに常に存在することが知られるPCNAに対する抗体を用いて、2者の関係を間接免疫2重染色法を用いて解析した。GO期でもDNAヘリカーゼBは核内にすでに存在するが、PCNAはS期に入ってからDNAと安定に複合体を形成することがわかった。2) WHERE:PCNAとDNAヘリカーゼBはReplication Site(RS)で常に挙動をともにするわけではなく、PCNAと局在が一致するものもあればいないものもある。以上を総合すると、ヘリカーゼBはPCNAよりは先にRSに入りDNA複製の開始に影響を与えうるが、その後Replication Forkから解離すると考えられる。3) WHO:two-hybridスクリーニングにて、ヘリカーゼBと相互作用する候補としてG/Tmismatch specific tymine DNA glycosylaseをクローニングした。G/TミスマッチはReplication Forkの通過前に修復される必要があり、DNA複製の開始付近で働くDNAヘリカーゼBとの相互作用は、ゲノムの配列の維持に重要な意味をもつ可能性がでてきた。

小鼠温度敏感的突变体TSFT848细胞在非抗药性温度下的DNA复制降低，DNA解旋酶B活性降低。在第一年，我们进行了一个实验，以确定解旋酶B是否是TSFT848细胞中温度敏感性的真正病变基因，几乎可以证实这是直接原因。今年，我们试图确定在何时，何处以及与谁一起参与DNA复制。 1）使用抗体对何时：DNA解旋酶B和针对PCNA的抗体分析两者之间的关系，PCNA已知在复制叉中不断存在，使用间接免疫染色方法。尽管即使在GO相中，DNA解旋酶B也已经存在于细胞核中，但发现PCNA在进入S相后与DNA形成了稳定的复合物。 2）其中：PCNA和DNA解旋酶B在复制位点（RS）并不总是共同行为，有些则与PCNA具有匹配的定位，而有些则没有。综上所述，解旋酶B可以在PCNA前进入RS并影响DNA复制的启动，但被认为随后与复制叉分离。 3）g/tmismatch特异性甲状腺素DNA糖基酶被克隆为WHO中与解旋酶B相互作用的候选：两杂化筛选。在通过复制叉之前，需要修复G/T不匹配，并且与DNA解旋酶B相互作用（在DNA复制开始接近）上已经出现了对维持基因组序列的潜在重要意义。