哺乳類細胞のDNA複製に関与するDNAヘリカーゼBの解析

哺乳动物细胞 DNA 复制中 DNA 解旋酶 B 的分析

基本信息

批准号：
09780619
负责人：
関政幸
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09780619/
关键词：
DNA複製 DNAヘリカーゼB PCNA 温度感受性変異株 Replication Foci

项目摘要

マウス温度感受性変異株tsFT848細胞は、非許容温度でDNA複製低下及びDNAヘリカーゼB活性の低下が観察される。初年度ではヘリカーゼBがtsFT848細胞の温度感受性の真の原因遺伝子か決定する実験を行い、直接の原因であることをほぼ確定できた。本年度は、ヘリカーゼBがいつ・どこで・誰とDNA複製に関与するか特定することを試みた。1) WHEN:DNAヘリカーゼBに対する抗体とReplication Forkに常に存在することが知られるPCNAに対する抗体を用いて、2者の関係を間接免疫2重染色法を用いて解析した。GO期でもDNAヘリカーゼBは核内にすでに存在するが、PCNAはS期に入ってからDNAと安定に複合体を形成することがわかった。2) WHERE:PCNAとDNAヘリカーゼBはReplication Site(RS)で常に挙動をともにするわけではなく、PCNAと局在が一致するものもあればいないものもある。以上を総合すると、ヘリカーゼBはPCNAよりは先にRSに入りDNA複製の開始に影響を与えうるが、その後Replication Forkから解離すると考えられる。3) WHO:two-hybridスクリーニングにて、ヘリカーゼBと相互作用する候補としてG/Tmismatch specific tymine DNA glycosylaseをクローニングした。G/TミスマッチはReplication Forkの通過前に修復される必要があり、DNA複製の開始付近で働くDNAヘリカーゼBとの相互作用は、ゲノムの配列の維持に重要な意味をもつ可能性がでてきた。

在小鼠温度敏感突变体 tsFT848 细胞中，在不允许的温度下观察到 DNA 复制减少和 DNA 解旋酶 B 活性降低。第一年，我们进行了实验以确定解旋酶B是否是tsFT848细胞温度敏感性的真正致病基因，并且几乎可以肯定它是直接原因。今年，我们试图确定解旋酶 B 何时、何地以及与谁参与 DNA 复制。 1) 使用针对 WHEN:DNA 解旋酶 B 的抗体和针对已知始终存在于复制叉中的 PCNA 的抗体，使用间接双重免疫染色分析两者之间的关系。尽管DNA解旋酶B即使在GO期就已经存在于细胞核中，但PCNA在进入S期后被发现与DNA形成稳定的复合物。 2) 地点：PCNA 和 DNA 解旋酶 B 并不总是在复制位点 (RS) 一起发挥作用；有些与 PCNA 一起定位，而另一些则不然。综上所述，解旋酶 B 似乎可以在 PCNA 之前进入 RS 并影响 DNA 复制的启动，但随后从复制叉上解离。 3）在WHO：双杂交筛选中，G/T错配特异性酪胺DNA糖基化酶被克隆为与解旋酶B相互作用的候选酶。 G/T 错配需要在通过复制叉之前进行修复，并且与 DNA 解旋酶 B（在 DNA 复制开始时起作用）的相互作用可能对维持基因组序列具有重要意义。