ORC4変異マウスを用いた個体レベルでの細胞周期研究

使用 ORC4 突变小鼠进行个体水平的细胞周期研究

基本信息

批准号：
15657045
负责人：
浅野雅秀
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年までにOrigin Recognition Complex (ORC)を構成するサブユニットの1つであるOrc4変異マウスが胎生4.5日目以降にアポトーシスを起こして致死となることを明らかにしたが、今年度はホモ変異胚をレスキューするためにloxP配列で挟んだOrc4遺伝子を導入したトランスジェニック(Tg)マウスの作出を行った。Orc4 cDNAをloxP配列で挟み、マーカー遺伝子としてInternal Ribosomal Entry Siteの制御下にGFPが発現するようにしたOrc4-GFPベクターを作製した。プロモーターにはCAGプロモーターとPGKプロモーターを用いた。まず、HeLa細胞およびNIH3T3細胞に導入して、GFPが発現することを確認した。次に、PGKプロモーター制御下にOrc4が発現するベクターを用いてTgマウスの作出を試みた結果、現在のところ2系統のTgマウスの作出に成功したが、内在性Orc4遺伝子のホモ変異マウスをレスキューするものは得られなかった。導入遺伝子由来のOrc4の発現を成体の臓器別に調べた結果、脳、小腸、筋肉、胸腺、脾臓、精巣では強い発現が確認できたが、心臓、肺、肝臓では弱い発現しか認められず、腎臓ではほとんど発現が認められなかった。内在性のOrc4はこれらの臓器においてほぼ同じレベルで発現していることから、ホモ変異マウスが生存できないのは導入遺伝子の発現が弱いためと考えられた。そこで、さらにTgマウスを作成すると共に、初期胚では導入遺伝子由来のOrc4の発現が十分であり、胚性幹細胞が樹立できる可能性があるので、ホモ変異胚の内部細胞塊培養を試みているところである。Orc4ホモ変異胚性幹細胞が樹立できれば、Creの発現によりOrc4を人為的に欠損させて、細胞周期やDNA複製におけるOrc4の役割を詳細に解析することができる。

去年，我们发现 Orc4（构成起源识别复合体 (ORC) 的亚基之一）的小鼠突变体会在胚胎第 4.5 天后发生细胞凋亡并死亡。为了拯救目的，我们用 Orc4 培育了转基因 (Tg) 小鼠。夹在loxP序列之间的基因。创建了 Orc4-GFP 载体，其中 Orc4 cDNA 夹在 loxP 序列之间，并且 GFP 在内部核糖体进入位点的控制下表达为标记基因。使用CAG启动子和PGK启动子作为启动子。首先，将其导入HeLa细胞和NIH3T3细胞，确认了GFP的表达。接下来，我们尝试使用在PGK启动子控制下表达Orc4的载体来产生Tg小鼠，到目前为止我们已经成功地产生了两种Tg小鼠品系，但我们还没有拯救出内源Orc4基因纯合的小鼠。没有得到我想要的。检查源自转基因的Orc4在各成体器官中的表达，结果发现，在脑、小肠、肌肉、胸腺、脾脏和睾丸中确认了强表达，但在心脏、肺、和肝脏中，并且在肾脏中几乎没有观察到表达。由于内源性Orc4在这些器官中的表达水平大致相同，因此人们认为纯合突变小鼠无法生存是由于转基因表达较弱。因此，除了创建Tg小鼠外，我们目前正在尝试培养纯合突变胚胎的内细胞团，因为转基因衍生的Orc4在早期胚胎中的表达已经足够，并且有可能将胚胎干细胞转化为胚胎干细胞。成立。如果能够建立Orc4纯合突变胚胎干细胞，可以通过表达Cre来人为删除Orc4，并详细分析Orc4在细胞周期和DNA复制中的作用。