ORC4変異マウスを用いた個体レベルでの細胞周期研究

使用 ORC4 突变小鼠进行个体水平的细胞周期研究

基本信息

批准号：
15657045
负责人：
浅野雅秀
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年までにOrigin Recognition Complex (ORC)を構成するサブユニットの1つであるOrc4変異マウスが胎生4.5日目以降にアポトーシスを起こして致死となることを明らかにしたが、今年度はホモ変異胚をレスキューするためにloxP配列で挟んだOrc4遺伝子を導入したトランスジェニック(Tg)マウスの作出を行った。Orc4 cDNAをloxP配列で挟み、マーカー遺伝子としてInternal Ribosomal Entry Siteの制御下にGFPが発現するようにしたOrc4-GFPベクターを作製した。プロモーターにはCAGプロモーターとPGKプロモーターを用いた。まず、HeLa細胞およびNIH3T3細胞に導入して、GFPが発現することを確認した。次に、PGKプロモーター制御下にOrc4が発現するベクターを用いてTgマウスの作出を試みた結果、現在のところ2系統のTgマウスの作出に成功したが、内在性Orc4遺伝子のホモ変異マウスをレスキューするものは得られなかった。導入遺伝子由来のOrc4の発現を成体の臓器別に調べた結果、脳、小腸、筋肉、胸腺、脾臓、精巣では強い発現が確認できたが、心臓、肺、肝臓では弱い発現しか認められず、腎臓ではほとんど発現が認められなかった。内在性のOrc4はこれらの臓器においてほぼ同じレベルで発現していることから、ホモ変異マウスが生存できないのは導入遺伝子の発現が弱いためと考えられた。そこで、さらにTgマウスを作成すると共に、初期胚では導入遺伝子由来のOrc4の発現が十分であり、胚性幹細胞が樹立できる可能性があるので、ホモ変異胚の内部細胞塊培養を試みているところである。Orc4ホモ変異胚性幹細胞が樹立できれば、Creの発現によりOrc4を人為的に欠損させて、細胞周期やDNA複製におけるOrc4の役割を詳細に解析することができる。

直到去年，据透露，ORC4突变小鼠是构成原点识别复合物（ORC）的亚基之一，在胚胎生命的第4.5天后经历了凋亡，导致致死性。但是，今年，我们创建了与夹在LOXP序列之间的ORC4基因引入的转基因（TG）小鼠，以营救同性恋胚胎。制备了ORC4-GFP载体，其中将ORC4 cDNA夹在LOXP序列之间，而GFP则在内部核糖体入口位点作为标记基因的控制下表达。 CAG启动子和PGK启动子用作启动子。首先，将其转染到HeLa细胞和NIH3T3细胞中，以确认表达GFP。接下来，我们尝试使用在PGK启动子控制下使用表达ORC4的向量ORC4生成TG小鼠，结果，我们成功地产生了两只TG小鼠菌株，但没有任何拯救内源性ORC4基因的同源小鼠的菌株。通过成人器官器官检查了源自转基因的ORC4的表达，尽管在大脑中证实了强烈的表达，但小肠，肌肉，胸腺，胸腺，脾和睾丸，但仅在心脏，肺和肝脏中观察到弱表达，并且在肾脏中几乎没有表达。由于内源性ORC4在这些器官中大致相同的水平表达，因此人们认为同型小鼠无法生存的原因是由于转基因表达弱。因此，除了创建TG小鼠外，我们还试图培养同源物胚胎的内部细胞肿块，因为在早期胚胎中源自转基因的ORC4的表达足以建立胚胎干细胞。如果可以建立ORC4同源胚胎干细胞，则可以通过CRE表达人为缺乏ORC4，并且可以详细分析ORC4在细胞周期中的作用和DNA复制。