Analysis of galactose carbohydrates regulating homing and differentiation of HSC in the bone marrow niche

半乳糖碳水化合物调节骨髓微环境中 HSC 归巢和分化的分析

基本信息

批准号：
21H02389
负责人：
浅野雅秀
金额：
$ 11.15万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

１）HSCのホーミングや分化の制御に関わる糖タンパク質とその糖鎖構造の解明これまでのHSCの骨髄へのホーミングに必須のCXCR4の解析において，そのリガンドCXCL12との結合に重要なCXCR4のN末端の38アミノ酸に存在するN型糖鎖やO型糖鎖の付加可能部位にそれぞれ点変異を導入した変異型CXCR4を作製した。これを培養細胞に導入して，Wound healing assayとTranswell migration assayで遊走活性を測定したところ，２ヶ所のO型糖鎖の付加可能部位が重要であることがわかった。さらに，CXCR4の遊走活性シグナル伝達に関与するFAKなどのリン酸化が，この２ヶ所の変異で低下することがわかった。また，レクチンブロットやウエスタンブロット解析により，この２ヶ所にはO型糖鎖が結合していることが示唆された。そこでCRISPR/Cas9法を用いてCXCR4遺伝子にこの２ヶ所の変異を導入したマウスを作製中であり，目的のマウスが作製できたら，このマウスから調整したHSCを野生型マウスに移植して，骨髄へのホーミング・生着能を解析する。２）HSC特異的β4GalT-1欠損マウスの作製と解析HSCや造血前駆細胞で特異的にCreを発現するVav-iCreマウスとβ4GalT-1 floxマウスの交配により，HSC特異的β4GalT-1欠損マウスを作製中である。このマウスのHSCを野生型マウスに移植して，骨髄へのホーミング・生着能を解析することにより，ホーミング異常がHSCの糖鎖欠損によることを証明する。また，このマウスの骨髄細胞の分化段階をFACSで解析して，HSCの分化異常がその糖鎖異常に起因することを明らかにする。

1) Elucidation of glycoproteins involved in the regulation of HSC homing and differentiation and their glycan structure In the analysis of CXCR4, which is essential for homing HSCs to the bone marrow, we have created a mutant CXCR4 in which point mutations are introduced at the sites where N-type glycans and O-type glycans can be added, which are important for binding to the ligand CXCL12。将其引入培养的细胞中，并使用伤口愈合测定法和Transwell迁移测定法测量了迁移活性，发现可以添加O型聚糖的两个地点很重要。此外，发现FAK的磷酸化和CXCR4迁移活性信号的其他物质的磷酸化降低了这两个突变。此外，凝集素和蛋白质印迹分析表明，O型糖链与这两个部位结合。因此，使用CRISPR/CAS9方法将这两个突变引入CXCR4基因的小鼠正在使用，一旦产生了所需的小鼠，调整后的HSC就会移植到野生型小鼠中，以分析其归巢能力和植入骨髓的能力。 2）创建和分析HSC特异性的β4GALT-1缺陷小鼠，我们目前正在通过交配VAV-ICRE小鼠在HSC和hscs和造血祖细胞和β4GALT-1 Flox小鼠中特异性表达CRE来制备HSC特异性的β4GALT-1缺陷小鼠。通过将HSC从这些小鼠移植到野生型小鼠中，并分析归巢和植入骨髓的能力，我们证明了归因异常是由于HSC中的糖基化缺乏造成的。此外，FACS分析了小鼠骨髓细胞的分化阶段，以表明HSC的异常分化是由异常的糖基化引起的。