Analysis of galactose carbohydrates regulating homing and differentiation of HSC in the bone marrow niche

半乳糖碳水化合物调节骨髓微环境中 HSC 归巢和分化的分析

基本信息

批准号：
21H02389
负责人：
浅野雅秀
金额：
$ 11.15万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

１）HSCのホーミングや分化の制御に関わる糖タンパク質とその糖鎖構造の解明これまでのHSCの骨髄へのホーミングに必須のCXCR4の解析において，そのリガンドCXCL12との結合に重要なCXCR4のN末端の38アミノ酸に存在するN型糖鎖やO型糖鎖の付加可能部位にそれぞれ点変異を導入した変異型CXCR4を作製した。これを培養細胞に導入して，Wound healing assayとTranswell migration assayで遊走活性を測定したところ，２ヶ所のO型糖鎖の付加可能部位が重要であることがわかった。さらに，CXCR4の遊走活性シグナル伝達に関与するFAKなどのリン酸化が，この２ヶ所の変異で低下することがわかった。また，レクチンブロットやウエスタンブロット解析により，この２ヶ所にはO型糖鎖が結合していることが示唆された。そこでCRISPR/Cas9法を用いてCXCR4遺伝子にこの２ヶ所の変異を導入したマウスを作製中であり，目的のマウスが作製できたら，このマウスから調整したHSCを野生型マウスに移植して，骨髄へのホーミング・生着能を解析する。２）HSC特異的β4GalT-1欠損マウスの作製と解析HSCや造血前駆細胞で特異的にCreを発現するVav-iCreマウスとβ4GalT-1 floxマウスの交配により，HSC特異的β4GalT-1欠損マウスを作製中である。このマウスのHSCを野生型マウスに移植して，骨髄へのホーミング・生着能を解析することにより，ホーミング異常がHSCの糖鎖欠損によることを証明する。また，このマウスの骨髄細胞の分化段階をFACSで解析して，HSCの分化異常がその糖鎖異常に起因することを明らかにする。

1）阐明参与HSC归巢和分化调节的糖蛋白及其糖链结构在之前对HSC归巢至骨髓所必需的CXCR4的分析中，CXCR4的N端对于与骨髓的结合非常重要其配体CXCL12我们创建了一个突变体CXCR4，其中在N-聚糖和O-聚糖的38个可添加的氨基酸位点引入了点突变。当将其引入培养细胞并使用伤口愈合测定和transwell迁移测定测量迁移活性时，发现可以添加O型糖链的两个位点很重要。此外，还发现参与CXCR4趋化活性信号转导的FAK磷酸化因这两种突变而减少。此外，凝集素印迹和蛋白质印迹分析表明O型糖链与这两个位点结合。因此，我们目前正在利用CRISPR/Cas9方法创建将这两个突变引入CXCR4基因的小鼠，一旦创建出所需的小鼠，由这些小鼠制备的HSC将被移植到野生型小鼠中并进行骨髓分析归巢和植入能力。 2) HSC特异性β4GalT-1缺陷型小鼠的生成和分析通过将在HSC和造血祖细胞中特异性表达Cre的Vav-iCre小鼠与β4GalT-1 flox小鼠杂交，我们产生了HSC特异性β4GalT-1缺陷型小鼠目前正在建设中。通过将该小鼠的造血干细胞移植到野生型小鼠体内，并分析其在骨髓中的归巢和定植能力，我们将证明归巢异常是由于造血干细胞中碳水化合物链的缺陷所致。此外，我们将利用FACS分析这些小鼠骨髓细胞的分化阶段，并证明HSC的异常分化是由异常的糖链引起的。