葉緑体in vitro RNAエディティング・翻訳共役系の確立

叶绿体体外RNA编辑/翻译耦合系统的建立

基本信息

批准号：
13874111
负责人：
杉浦昌弘
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Nagoya City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

高等植物の葉緑体の転写産物では、CからUへのRNAエディティングにより一部の配列が変化する。その中で、ACGがAUGに変化して翻訳開始コドンを生じる。このエディティングから翻訳開始までの分子機構を解析する手法としてRNAエディティングと翻訳を連動して行うin vitro系の開発のため以下の研究を行った。1.In vitro系の改良昨年度は葉緑体in vitroRNAエディティング系の大幅な改良を行ったが、この系はP32標識mRNA基質を用いる。この基質調製が煩雑なため、より簡単な非アイソトープ法の開発を行った。蛍光標識ダイデオキシヌクレオチドとプライマー伸長法を組み合わせ効率よくアッセイできる手法が出来上がった。一方の、in vitro翻訳系の方も非アイソトープ化を進め、蛍光タンパク質mRNAを目的の葉緑体mRNAの後方に結合させ、翻訳産物を蛍光強度でアッセイする手法も完成した。上記の両in vitro系を一緒にして、RNAエディティングと翻訳の共役系の確立をめざしたが、両系の調製液の組成と反応組成が異なるため、充分活性のある共役系がまだ得られていない。2.In vitro系に適した植物種の探索一貫して最も解析の進んでいるタバコを使用してきたが、エンドウ葉緑体よりin vitroRNAエディティング系の開発をしたが、RNアーゼ活性が高いため、in vitro翻訳系の開発には適していないことが明らかになった。そこでキュウリ葉緑体についてin vitro系開発の適合性の調査を行ったが、充分な結果を出すまでには得られなかった。

在高等植物的叶绿体转录本中，一些序列由于 C 到 U RNA 编辑而发生变化。其中，ACG 变为 AUG 以生成翻译起始密码子。我们进行了以下研究，开发了一种连接 RNA 编辑和翻译的体外系统，作为分析从编辑到翻译起始的分子机制的方法。 1.体外系统的改进去年，我们对叶绿体体外RNA编辑系统进行了重大改进，该系统使用P32标记的mRNA底物。由于这种底物制备很复杂，我们开发了一种更简单的非同位素方法。通过结合荧光标记的双脱氧核苷酸和引物延伸创建了一种有效的测定方法。另一方面，体外翻译系统也已实现非同位素化，完成了在目标叶绿体mRNA的背面附着荧光蛋白mRNA，通过荧光强度测定翻译产物的方法。。我们的目的是通过结合上述两个体外系统来建立RNA编辑和翻译的耦合系统，但由于两个系统的制备溶液的组成和反应组成不同，目前还不可能获得耦合系统还没有足够的活动。 2. 寻找适合体外系统的植物物种我们一直使用具有最先进分析的烟草，但我们使用豌豆叶绿体开发了体外 RNA 编辑系统，但由于其高 RNase 活性，很明显，它不适合体外翻译系统的开发。因此，我们研究了黄瓜叶绿体体外系统开发的适用性，但未能获得足够的结果。