ヒト脂肪肝癌細胞を用いたマクロリポファジー・ライソソーム解析と癌化抑制法の開発

使用人脂肪肝癌细胞进行巨噬脂/溶酶体分析以及癌变抑制方法的开发

基本信息

批准号：
18H00471
负责人：
林芳弘
金额：
$ 0.33万
依托单位：
Kochi University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18H00471/
关键词：
脂肪化肝細胞癌オートファジー

项目摘要

【研究目的】近年、脂肪肝患者は増加しており、一部の症例は、非アルコール性脂肪肝炎(non-alcoholic steatohepatitis ; NASH)を経て重症化し、肝硬変そして肝細胞癌へと進展する。NASHの治療法は、食事制限や運動以外の方法はなく、有効な治療法もまだ確立されていない。一方、申請者は、高分化肝癌細胞株に、癌抑制遺伝子であるFbxw7(Fbox-and WD repeats domain-cotaining 7)を遺伝子導入しノックダウンすると、肝癌細胞に多数の脂肪滴が出現し、逆に脂質代謝調節機能(マクロリポファジー)機能が亢進する現象を見出した。本研究は、肝癌細胞の脂肪滴沈着とオートファジー機能との相互作用について追究し、ヒト脂肪肝の肝細胞癌への進展にどのように関与しているのかを検討し、臨床に役立てる。【研究結果】肝癌細胞(Huh-7)のfbxw7が欠失すると電子顕微鏡観察では、脂肪滴の増加と大型化が見られた。また、脂肪滴代謝に関連するSREBP-1(sterol regulatory elementbinding protein-1)タンパクは、Western blot法で成熟型SREBP-1の核内移行の増加を認め、免疫組織化学的にも陽性強度増加を確認した。今回、培養方法を通常の2次元平面培養に加え、生体内の状態に近く、癌の生物学特性をより忠実に反映する3次元培養(スフェロイド作製)による解析を追加実験として行った。その結果、2次元培養では、fbxw7ノックダウン株は、オートファジー機能の検討では、LC3B増加とp62/SQSTM1の低下を認め、促進していることが分かった。Realtime PCRを用いたmRNA解析でも、オートファジー機能の活発化を認めた。しかし、3次元培養では、スフェロイド作製3日目では、オートファジーはノックダウン・コントロール群間には明らかな差が見られなかったが、7日目のウェスタンブロットの解析では、ノックダウン群のLC3B発現は低下、逆にp62/SQSTMタンパク発現は増加し、オートファジー機能の低下が観察された。NASHのFbxw7・オートファジーと肝癌発生に関する臨床病理学的解析では、脂肪滴の多い肝細胞癌部は、少ない肝癌細胞に比べfbxw7陽性像が弱く、同時に、オートファジー機能も低下していることが分かった。【考察】Fbxw7の発現低下は、脂肪滴の多い肝細胞癌の発生に、そして、オートファジー機能の低下が肝癌の脂肪化およびその悪化に関係し、今後、肝癌治療のターゲットになる可能性が示唆された。

[研究目标]近年来，脂肪肝患者的数量增加了，在患有非酒精性脂肪性肝炎（NASH）后，有些病例变得严重，导致肝硬化和肝细胞癌。除了饮食限制或运动外，没有其他方法可以治疗NASH，而且还没有建立有效的治疗方法。另一方面，申请人发现，当抑制癌症基因FBXW7（Fbox-and WD重复域诱导域7）被转移并在良好的肝癌细胞系中撞倒时，在肝癌细胞中出现了许多脂质液滴，相反，脂质的代谢调节性功能（macropolpoggy）均提高了。这项研究研究了肝瘤细胞中脂质液滴沉积与自噬功能之间的相互作用，并研究了它如何参与人类脂肪肝进入肝细胞癌的进展，并且在临床用途中很有用。 [结果]当删除肝癌细胞中的FBXW7时，脂质液滴增加并通过电子显微镜观察到大小的增加。此外，与脂质液滴代谢相关的SREBP-1（固醇调节元件订阅蛋白-1）蛋白显示，通过蛋白质印迹方法对成熟SREBP-1的核易位增加，并且证实了免疫组化结果的正面强度的增加。在本文中，我们将培养方法添加到通常的二维平面培养物中，并使用3D培养（球形生产）进行了其他实验，这些实验与有机体的状态非常相似，并更忠实地反映了癌症的生物学特性。结果，发现在二维培养物中，FBXW7敲低菌株在检查自噬功能时会促进LC3B的增加，P62/SQSTM1降低。使用实时PCR进行的mRNA分析还表明，自噬功能被激活。但是，在3D培养物中，在球体产生的第3天敲低组和对照组之间没有发现自噬的明显差异，但是在第7天的蛋白质印迹分析中，敲低组中的LC3B表达降低了，相反，P62/SQSTM蛋白的表达增加，导致自动噬功能的降低。 NASH的FBXW7自噬和肝癌发育的临床病理分析表明，富含脂质液滴的肝细胞癌区域的FBXW7阳性图像较弱，同时具有降低的自噬功能。 [讨论] FBXW7表达的降低与高脂质液滴的肝细胞癌的发展有关，自噬功能的下降与肝癌的脂肪和恶化有关，这表明它可能在将来成为肝癌治疗的靶标。