FBXW7欠損脂肪化肝癌細胞を用いたオートファジー機能解析とNASH治療法の開発

FBXW7缺陷型脂肪肝癌细胞自噬功能分析及NASH治疗进展

• 批准号: 17H00586
• 负责人: 林 芳弘
• 金额: $ 0.33万
• 依托单位: Kochi University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
• 财政年份: 2017
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2017 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17H00586/
• 关键词: 肝癌細胞; オートファジー; カテプシンE; 肝癌細胞; オートファジー; カテプシンE

【研究目的】近年、日本を含めた先進国で脂肪の多い食事などが原因で脂肪肝患者は増加しており、その一部の脂肪肝は、非アルコール性脂肪肝炎(non-alcoholic steatohepatitis ; NASH)を経て重症化、肝硬変そして肝細胞癌へと進展する症例もあり危惧されている。しかし、NASHの治療法は、食事制限や運動以外の方法はなく、有効な治療法もまだ確立されていない。本研究では、Fbxw7タンパクの欠損脂肪化肝癌細胞を用いて脂肪滴代謝機能の一つであるオートファジー機能に加えてライソソームにも注目し、Fbxw7タンパクがオートファジー・ライソソーム関連タンパクに与える影響やその発現変化について解析し、ヒト脂肪肝、NASH、肝硬変そして肝細胞癌への進展にどのように関与しているのかを検討する。【研究計画】Fbxw7欠失脂肪化肝癌細胞を樹立し、脂肪滴代謝に関連するmRNAおよびタンパク質をそれぞれReal-time PCR法およびWestern blot法で解析し、脂肪滴など微細構造については透過型電子顕微鏡を用いて詳細に観察する。In vivo studyとして、遺伝子導入肝癌細胞をヌードマウスへ移植し脂肪滴数・増殖能を検討するとともに、マクロリポファジーおよびライソソームタンパクの局在と発現量を光顕・電顕的免疫組織化学法により分析する。臨床病理学的にはNASH症例と肝細胞癌のFbxw7・マクロリポファジー関連タンパクを免疫組織化学法で検出、その発現と肝細胞癌への進展について解析する。【研究成果】Fbxw7をknock-downすると肝癌細胞の脂肪化が見られた。通常、脂肪滴の沈着により、肝癌細胞は機能が低下するが、オートファジーに関しては逆に活動の活発化を認め、電顕でもマクロリポファジーの増加が観察された。その原因を解明するために網羅的にマイクロアレイ解析を行った結果、ライソソームに関連するcathepsin Eの発現が増加していることを発見した。また、Fbxw7 knockdown肝癌細胞のヌードマウスによる移植では、増殖伸展した肝癌細胞は、脂肪滴の著明な減少が見られ、免疫組織化学的解析でcathepsin Eの発現増強が認められた。これらの結果から、肝細胞の脂肪化と脂肪滴の沈着量には、ユビキチンリガーゼであり癌抑制遺伝子であるFbxw7およびライソソームタンパクであるcathepsin Eが関与していることが示唆され、今後の遺伝子治療薬のターゲットとなる可能性がある。

[研究目的]近年来，由于包括日本在内的发达国家的饮食脂肪饮食，脂肪肝患者的数量一直在增加，其中一些脂肪肝患者处于危险之中，因为他们经历了非酒精性脂肪性肝炎（NASH），导致严重的症状，以及严重的症状，以及肝硬化和肝细胞细胞癌。但是，除了饮食限制或运动外，没有其他方法可以治疗NASH，并且尚未确定有效的治疗方法。在这项研究中，除自噬功能外，我们还将重点关注溶酶体，这是使用FBXW7蛋白缺乏脂肪肝癌细胞的脂质液滴代谢函数之一，并分析FBXW7蛋白对自噬 - 噬菌体与体积体相关蛋白质的脂肪的影响，并研究其表达和培训的反应，它们与它们相关的含有涉及的含有涉及的液体，这些蛋白质涉及涉及的液体，与它们相关，是涉及的含有涉及的蛋白质，并且与它们相关的含量涉及的是涉及的。肝硬化和肝细胞癌。 [研究计划]建立了FBXW7缺陷型脂肪肝癌细胞，分别使用实时PCR和Western印迹方法分别分析了与脂质液滴代谢相关的mRNA和蛋白质，并使用传输电子显微镜详细观察到诸如脂质液滴的细胞结构，例如脂质液滴。在体内研究中，将转基因肝癌细胞移植到裸鼠中，以检查脂质液滴和增殖潜力的数量，并通过光和电子微观免疫组织来分析大酚和溶酶体蛋白的定位和表达。在临床病理学上，通过免疫组织化学方法检测到NASH病例中的FBXW7大酚相关蛋白和肝细胞癌，分析了它们的表达和进展为肝细胞癌。 [研究结果]当FBXW7被击倒时，观察到肝癌细胞的缺陷。通常，脂质液滴沉积会导致肝癌细胞功能的降低，但在自噬中观察到活性，并且在电子显微镜中观察到了大量寄生虫的增加。为了阐明原因，我们进行了全面的微阵列分析，发现与溶酶体相关的组织蛋白酶E的表达增加了。 Furthermore, when transplanting Fbxw7 knockdown hepatoma cells with nude mice, proliferation and extension of hepatoma cells showed a marked reduction in lipid droplets, and immunohistochemical analysis showed an enhanced expression of cathepsin E. These results suggest that the fatiation of hepatocytes and the amount of lipid droplet deposited is involved in Fbxw7, a ubiquitin ligase以及肿瘤抑制基因和溶酶体蛋白的组织蛋白酶E，可能成为未来基因治疗药物的靶标。