ゲノムワイドRNA干渉スクリーニング法による腫瘍溶解RNAウイルス増殖機構の解明

利用全基因组RNA干扰筛选方法阐明溶瘤RNA病毒增殖机制

基本信息

批准号：
25430151
负责人：
井上博之
金额：
$ 3.41万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

まず、in vitro細胞傷害性試験（クリスタルバイオレット法）の結果、CVA11感染により標準治療抵抗性ヒト癌細胞であるオキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞（WiDr）、トリプルネガティブ乳癌細胞(MDA-MB231及びMDA-MB432) 、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤ゲフィチニブ２次耐性小細胞肺癌細胞（H1975）あるいは乳癌MCF7細胞に対し、高い殺細胞傷害性を呈した（MOI=0.001～0.1）。次に、ハイスループットRNA干渉スクリーニング法に用いるレンチウイルスshRNAライブラリー（DCIPHER, Human module 1, 5000 gene targerts, 27,500 shRNAs）を293T細胞へトランスフェクションし構築し、上記レンチウイルスshRNAライブラリーをH1975肺腺癌及びMESO4悪性中皮腫細胞株に感染させ、各遺伝子ノックダウンした後、腫瘍溶解性RNAウイルス（CVA11）を感染させ腫瘍溶解性に抵抗性を示す癌細胞コロニーが出現することを確認した。癌細胞コロニーを回収し細胞ペレットよりRNAを抽出後、次世代シークエンスによる挿入遺伝子配列を解析した結果、VHL, BTK, IGFBP3、CARD6、MADD、TRAF4等のアポトーシスを含む細胞死関連分子及びSOX2等の幹細胞関連分子が同定された。実際に、アポトーシスを阻害する汎カスパーゼ阻害剤をCVA11感染時に併用したところ、癌細胞傷害性が有意に減少したことからアポトーシス経路がCVA11ウイルス増殖に関与している可能性が示唆された。

首先，体外细胞毒性试验（结晶紫法）的结果，奥沙利铂耐药结肠癌细胞（WiDr）、三阴性乳腺癌细胞（MDA-MB231和MDA-MB432），对EGFR酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼继发耐药小细胞肺癌细胞（H1975）或乳腺癌MCF7细胞（MOI=0.001-0.1）表现出高细胞毒性。接下来，我们创建了一个慢病毒shRNA文库（DCIPHER，Human module 1，5000个基因靶标，27,500个通过转染293T细胞构建上述慢病毒shRNA文库，感染H1975肺腺癌和MESO4恶性间皮瘤细胞系，敲低各基因，证实出现抗溶瘤的癌细胞集落。收集癌细胞集落并从细胞沉淀中提取RNA后，我们使用二代测序分析了插入的基因序列，结果发现细胞死亡相关分子，包括VHL、BTK、IGFBP3等凋亡相关分子， CARD6、MADD、TRAF4、SOX2等干细胞相关分子已被鉴定。事实上，当抑制细胞凋亡的pan-caspase抑制剂与CVA11感染联合使用时，癌细胞毒性显着降低，表明细胞凋亡途径可能参与CVA11病毒增殖。