棘皮動物オーガナイザー因子の同定

棘皮动物组织因子的鉴定

基本信息

批准号：
14780561
负责人：
山本卓
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14780561/
关键词：
棘皮動物オーガナイザーウニ分泌性因子誘導

项目摘要

昨年シグナル配列トラップ法により選別した560個の酵母のクローンから、プラスミドDNAをPCR法により調製し、すべての塩基配列を決定した。塩基配列からシグナル配列を含むN末端のアミノ酸配列を予測し、その配列がシグナル配列である可能性をPsort programにより調べた。その結果、約50%クローンがシグナル配列を含む可能性が示され、酵母によるシグナル配列のスクリーニングは成功していることがわかった。さらに、その配列を用いてBlast searchにより既知の塩基配列との相同性を調べたところ、既知の分泌性酵素あるいは未知の分泌因子cDNAクローンとの相同性が確認された。これらのクローンのステージ別の発現量を調べるため、cDNAのPCR断片をフィルターにプロットしたマクロアレイフィルターを複数枚作製中である。また、プローブ用の各ステージ(未孵化胞胚期、間充織胞胚期、原腸胚期)の総RNAについてはすべてのステージで調製した。発現の局在を調べるために、解離した小割球特異的および大・中割球特異的なプローブについても合わせて調製した。シグナル配列トラップ法でクローニングできるのは、タンパク質のN末端部分のみである。そのため、解析を進めていくために、全長cDNAをクローニングする必要がある。本年度は、孵化胞胚期と原腸胚期のRNAからそれぞれ約1000万の独立したcDNAクローンを含むプラスミドcDNAライブラリーを作製した。現在このライブラリーを用いて、興味深いクローンの全長cDNAをスクリーニングしている。

使用信号序列捕获法，从去年选出的560个酵母克隆中通过PCR制备质粒DNA，并确定了所有碱基序列。从碱基序列预测包含信号序列的N末端氨基酸序列，并使用Psort程序研究该序列是信号序列的可能性。结果显示，大约50%的克隆含有信号序列，表明基于酵母的信号序列筛选是成功的。此外，当使用该序列通过Blast搜索检查与已知碱基序列的同源性时，确认了与已知分泌酶或未知分泌因子cDNA克隆的同源性。为了分阶段研究这些克隆的表达水平，我们目前正在创建多个宏阵列过滤器，其中将 cDNA PCR 片段绘制在过滤器上。另外，在所有阶段制备用作探针的每个阶段(未孵化的囊胚阶段、间充质囊胚阶段和原肠胚阶段)的总RNA。为了研究表达的定位，还制备了针对解离的小卵裂球和大/中卵裂球的特异性探针。使用信号序列捕获方法只能克隆蛋白质的 N 末端部分。因此，为了进行分析，有必要克隆全长cDNA。今年，我们创建了一个质粒 cDNA 文库，其中包含约 1000 万个独立的 cDNA 克隆，每个克隆均来自孵化囊胚阶段和原肠胚阶段的 RNA。我们目前正在使用这个文库来筛选感兴趣克隆的全长 cDNA。