Studies on the pleiotropic functions and transcriptional regulation of gbx homeobox genes in the development of the vertebrate brain.

gbx同源盒基因在脊椎动物大脑发育中的多效性功能和转录调控研究。

基本信息

批准号：
21K06182
负责人：
弥益恭
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Saitama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

脊椎動物の発生において中脳後脳境界（MHB）は中脳、小脳のパターン形成を制御するシグナル分泌センターである。本研究では、MHB形成に関わるgbx遺伝子の機能と発現制御機構について、ゼブラフィッシュを用いて発生遺伝学研究を進めている。令和4年度はまず、gbxの峡部発生における機能の再評価のため、CRISPR/Cas9法により各gbx（gbx1、gbx2）の完全欠失変異体の作製を進め、これまでgbx1全欠失変異体の系統化を行った（gbx1dFD）。この変異体では原腸形成後期において、gbx1の発現は予想通りに消失するが、gbx2の発現には異常が認められず、gbx1の欠損下でもMHBは決定されること、gbx1はこの時期のgbx2発現に必要ないことが確認された。一方、gbxの転写制御機構にも取り組んでおり、gbx1については上流遺伝子（asb10）までの全上流領域（5.5 kb）の欠失変異体の系統化を完了した。この変異体において、後期原腸胚における後方神経板でのgbx1発現は正常であるが、体節形成終了期での後脳発現が消失した。つまり、上流5.5 kb内に後脳エンハンサーがあると推定された。転写調節能の上流内の分布については、egfp/luciferaseレポーターを用いた胚での転写調節能解析で明らかにした。また、この上流欠失変異体では後脳における神経分化の異常を観察しており、gbx1が後脳での神経分化に必要であることを示した。下流欠失変異体作製はまだ進行中であるが、並行して行った脊椎動物種間の大規模ゲノム配列比較の結果、下流2カ所に哺乳類以外の脊椎動物で保存された配列を見出し（DCS1/DCS2）、これらが原腸胚で転写活性化能を持つことも確認した。gbx2については、上流全域（130 kb）と下流全域（8 kb）の欠失変異体作製を引きつづき進めている。

在脊椎动物发育中，中脑-后脑边界（MHB）是控制中脑和小脑模式的信号分泌中心。在本研究中，我们利用斑马鱼进行发育遗传学研究，以研究参与 MHB 形成的 gbx 基因的功能和表达控制机制。在2020财年，我们将首先使用CRISPR/Cas9方法创建每个gbx（gbx1、gbx2）的完全缺失突变体，以重新评估gbx在峡部发育（gbx1dFD）中的功能。在该突变体中，gbx1表达如预期在原肠胚形成后期消失，但gbx2表达没有观察到异常，这表明即使在gbx1不存在的情况下也可以确定MHB不是表达所必需的。另一方面，我们也在研究gbx的转录控制机制，已经完成了gbx1整个上游区域（5.5 kb）直至上游基因（asb10）的缺失突变体的系统化。在该突变体中，gbx1 在原肠胚晚期的后神经板中表达正常，但在体节发生结束时后脑表达丢失。也就是说，推测上游5.5kb内存在后脑增强子。通过使用egfp/荧光素酶报告基因分析胚胎中的转录调节能力，阐明了转录调节能力的上游分布。此外，在该上游缺失突变体中观察到后脑神经分化异常，表明gbx1是后脑神经分化所必需的。尽管下游缺失突变体的构建仍在进行中，但通过并行进行的脊椎动物物种之间的大规模基因组序列比较，我们发现了两个在哺乳动物以外的脊椎动物中保守的下游序列（DCS1 / DCS2），并且还证实它们具有激活原肠胚转录的能力。关于gbx2，我们正在继续为整个上游区域（130 kb）和下游区域（8 kb）创建缺失突变体。