細胞膜脂質オーガナイザーとしてのPI-4キナーゼ複合体の機能とその破綻

PI-4激酶复合物作为细胞膜脂质组织者的功能及其分解

基本信息

批准号：
21H02694
负责人：
中津史
金额：
$ 10.98万
依托单位：
Niigata University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度の成果にもとづき、今年度はまず同定した新規メンブレンコンタクト局在分子の解析を行った。候補分子のひとつである脂質輸送タンパク質について、そのリガンドとなる脂質の同定を試みた。アミノ酸配列から脂質輸送に関与すると予想される機能ドメインを哺乳動物細胞に一過性に発現させ、FLAG抗体を用いてアフィニティー精製を行った後に、ゲルろ過クロマトグラフィーにより単量体を精製した。この精製サンプルを質量分析により解析し、リガンド脂質の探索を行った。これまでのところ、アミノ酸配列から予想される候補リガンド脂質以外に、新規のリガンド候補脂質を同定している。次に、これらリガンド候補脂質を用いて、新規・メンブレンコンタクト局在脂質輸送タンパク質の脂質輸送活性の測定を試みた。まず、新規のリガンド脂質に対する脂質輸送活性測定方法の樹立を行った。脂質輸送活性測定は、我々が樹立した人工脂質二重膜（リポソーム）を用いた蛍光測定解析系をベースに、検出方法を改変した。現在までのところ、特異的な輸送活性シグナルの検出に成功しているが、シグナルが弱いため反応条件およびリポソーム構成脂質種の検討を行っている。また、本研究では細胞膜PI4P合成酵素による細胞膜PI4P合成活性を鋭敏にモニターする必要があるため、細胞膜におけるPI4Pの検出・定量方法の樹立を行った。従来用いられてきたプローブに比べ、膜結合力が高くサイトゾルへの局在性が低いPI4P結合タンパク質を探索し、その候補分子を得た。この候補分子のPHドメインによる細胞膜PI4P認識・結合活性をイメージングにより詳細に解析した。これまでのところ、従来のPI4Pプローブと比較して、極めて高S/N比かつ特異的なPI4Pプローブとしての優れた特性が得られている。

根据去年的结果，今年我们首先分析了新发现的膜接触局部分子。我们试图鉴定充当脂质转运蛋白配体的脂质，脂质转运蛋白是候选分子之一。根据氨基酸序列预测参与脂质转运的功能结构域在哺乳动物细胞中瞬时表达，并在使用FLAG抗体亲和纯化后，通过凝胶过滤色谱法纯化单体。通过质谱分析该纯化样品以寻找配体脂质。到目前为止，除了从氨基酸序列预测的脂质之外，我们还鉴定了新的配体候选脂质。接下来，我们尝试使用这些配体候选脂质来测量新型膜接触定位脂质转运蛋白的脂质转运活性。首先，我们建立了一种测量新型配体脂质的脂质转运活性的方法。为了测量脂质转运活性，我们修改了基于使用我们建立的人工脂质双层膜（脂质体）的荧光测量分析系统的检测方法。到目前为止，我们已经成功检测到了特定的转运活性信号，但由于信号较弱，我们目前正在研究反应条件和脂质体构成脂质的类型。此外，在本研究中，由于需要通过细胞膜PI4P合酶灵敏地监测细胞膜PI4P合成活性，因此我们建立了一种检测和定量细胞膜中PI4P的方法。我们寻找一种比常规探针具有更高膜结合性和更低胞质定位的 PI4P 结合蛋白，并获得了其候选分子。通过成像详细分析了该候选分子的 PH 结构域对细胞膜 PI4P 的识别和结合活性。迄今为止，与传统的PI4P探针相比，已经获得了作为具有极高S/N比和特异性的PI4P探针的优异特性。