細胞内情報伝達系における局所Ca^<2+>動態の画像解析とイオンチャネル活性化制御

细胞内信号转导系统局部Ca^2+动态图像分析及离子通道激活控制

基本信息

批准号：
10169252
负责人：
渡辺稔
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Nagoya City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

単離平滑筋細胞に電位固定法を適用し、膜電流を記録するとともに、記録電極内からfluo-3を細胞に負荷しレーザー共焦点顕微鏡を用いて細胞内Ca^<2+>分布画像を同時に取得する手法を用いて、精管・膀胱・門脈等の興奮性の高い平滑筋細胞における興奮収縮連関の画像解析とCa^<2+>依存性K^+チャネル活性化の解析を行い、次の知見を得た。(1)細胞膜直下に局在する特定の筋小胞体(の一部分)は、活動電位などの脱分極時に、電位依存性Ca^<2+>チャネルを介したCa^<2+>流入によるCa^<2+>遊離機構の起点となり、数百ミリ秒持続するCa^<2+>ホットスポットを形成する。(2)膜直下筋小胞体からの局所遊離Ca^<2+>によるK^+チャネル活性化は、活動電位波形を制御し活動電位発生頻度を調節する。(3)この局所Ca^<2+>遊離は他の筋小胞体へCa^<2+>遊離を伝播した場合にのみ、収縮を誘発する可能性が高い。(4)このようなCa^<2+>ホットスポット形成という特定機能を持つ膜直下筋小胞体の数は、1細胞当り比較的少数(<20)と考えられる。一方、保持電位-40mV付近での観察から、膜直下の特定の筋小胞体(数箇所)から、自発的な一過性局所Ca^<2+>遊離(Ca^<2+>スパーク)が繰り返し生じ、近傍の細胞膜上のCa^<2+>依存性K^+チャネル(10-100個)を活性化することにより自発性・一過性の外向き電流(STOC)が生じることが示唆されている。Ca^<2+>スパークとSTOCの持続時間は半値幅50ミリ秒程度で、その発生に外液Ca^<2+>の流入は直接必要ではなく、特定の筋小胞体からのリアノジン受容体を介する自発性Ca^<2+>遊離によると考えられる。今回、上記の活動電位発生初期に重要な働きをする特定の筋小胞体のさらに一部で、Ca^<2+>スパークがほぼ定期的に生じるていること、それがSTOCと完全に同期していることを画像解析と膜電流の同時記録により明らかにした。Ca^<2+>スパークは心筋や骨格筋において興奮収縮連関の最少ユニットとして解析されている。一方、横行小管と筋小胞体の発達が悪い平滑筋においては、細胞膜直下の筋小胞体で生じるCa^<2+>スパークが細胞膜上のCa^<2+>依存性イオンチャネルを活性化して静止膜電位や興奮性、さらに筋緊張度の調節に関与していることが明らかとなった。静止時にSTOCを活性化するCa^<2+>スパーク部位は、脱分極時にはより大きく増幅され持続するCa^<2+>ホットスポット部位となる。

对分离的平滑肌细胞应用电压钳法，我们记录膜电流，从记录电极内将fluo-3加载到细胞中，并使用激光共聚焦显微镜对细胞内Ca ^ 2+ 分布进行同步成像。通过采集方法，我们分析了输精管、膀胱和门静脉等高兴奋性平滑肌细胞中的兴奋-收缩耦合和Ca^2+依赖性K^+通道激活的图像，我们获得了以下发现。 (1) 位于细胞膜正下方的特定肌浆网（部分）在动作电位等去极化过程中通过电压门控 Ca^<2+> 通道接收 Ca^<2+> 流入，成为^的起点。 <2+>释放机制并形成持续数百毫秒的Ca^<2+>热点。 (2)膜下肌浆网局部游离Ca^2+对K^+通道的激活控制动作电位波形和动作电位产生的频率。 (3)这种局部Ca 2+ 释放只有在传播到其他肌浆网时才可能诱导收缩。 (4)具有形成Ca ^ 2+ 热点的特定功能的膜下肌浆网的数量被认为相对较小(<20)/每个细胞。另一方面，在大约-40mV的保持电势下的观察表明，自发的、瞬时的局部Ca^<2+>释放(Ca^<2+>火花)发生在膜正下方的特定肌浆网(几个位置)。表明自发瞬态外向电流(STOC)是通过激活附近细胞膜上的Ca^2+门控K^+通道(10-100)而产生的。 Ca ^ 2+ 火花和STOC的持续时间在半最大值时约为50毫秒，并且外部流体Ca ^ 2+ 的流入并不是它们的产生直接需要的，但来自特定肌浆网的兰尼碱受体被激活。这被认为是由于Ca ^<2+> 自发释放所致。这次，我们发现Ca^<2+>火花几乎有规律地出现在肌浆网的特定部位，该部位在动作电位产生的早期阶段发挥着重要作用，并且它们与STOC完全同步。通过图像分析和同时记录膜电流。 Ca 2+ 火花已被分析为心肌和骨骼肌中兴奋-收缩耦合的最小单位。另一方面，在横管和肌浆网发育不良的平滑肌中，细胞膜正下方的肌浆网中产生的Ca^2+火花激活细胞膜上的Ca^2+门控离子通道。研究表明，它参与静息膜电位、兴奋性和肌张力的调节。在静止期间激活STOC的Ca ^ 2+ 火花位点成为Ca ^ 2+ 热点位点，该热点位点在去极化期间被大大放大并持续存在。