神経細胞の軸索誘導における分子メカニズムの同定

神经元轴突引导分子机制的鉴定

基本信息

批准号：
04F04712
负责人：
成宮周
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、繊維芽細胞の遊走・走化性に必要なシグナル分子がマウスの小脳顆粒細胞の遊走や軸索ガイダンスにも共通して重要であるかを解明することを目標とする。現在までに、それらの細胞系の初代培養手法を樹立した。単層培養グリア細胞上での小脳顆粒細胞の培養とともに、2次元ないし3次元における小脳顆粒細胞の分散培養や凝集培養での細胞動態が検討された。特に小脳顆粒細胞の凝集からの培養では、3次元のコラーゲンゲル内の培養でも2次元の培養でも印象的な神経突起伸長が観察された。引き続き解析には、蛍光顕微鏡での観察に適した後者の2次元培養を選択した。マウス胎児繊維芽細胞(MEF)については、心臓・肺・腎臓・体壁組織のうち、肺・体壁から単離したものが血小板由来成長因子(PDGF-BB)の濃度勾配に対して走化性を示したため、体壁由来のMEFを選択した。このように確立した初代培養系の走化性を観察するために、改良Dunn走化性チャンバーと多視野自動顕微鏡を用いたハイスループット観察系を樹立した。更に、RT-PCRによって、Cdc42サブファミリー(Cdc42,Tc10,Tcl,Chp)、Racサブファミリー(Rac1,2,3 and RhoG)のGTPアーゼがMEFに発現することを確認し、それらのcDNAを単離した。これらの分子の細胞遊走における役割や機能補完を解析する目的で、RNA干渉法を最適化した。現在のところ、Cdc42ノックダウンされたMEFが、細胞体の収縮とともに長く伸びた形態を示し、部分的な遊走の異常を示すことが観察された。しかしながら、走化性は保たれることから今まで重要と考えられてきたCdc42のシグナルとは別のシグナル機構が繊維芽細胞の走化性を制御することが示唆された。更に、今後Cdc42サブファミリーの2種の細胞系の遊走における役割を比較できるように、小脳顆粒細胞におけるRNA干渉法の最適化も行った。

在这项研究中，目标是阐明成纤维细胞所需的信号分子和跑步性能是否在小鼠脑脑颗粒细胞和轴引导中很常见。迄今为止，已经建立了这些细胞系统的第一代培养方法。以及在单个层状细胞培养物上的脑颗粒的培养物，在两个或三个维度中多样化培养的细胞动力学和脑颗粒的骨料培养。特别是，在小脑颗粒的聚集中，在3D胶原凝胶或两种维培养中都观察到了令人印象深刻的神经突出生长。为了进行分析，选择了适合用荧光显微镜观察的后两个维培养。对于小鼠胎纤维芽（MEF），由于性别而言，由于性别的生长因子（PDGF-BB），从心脏，肺部，肾脏和身体壁孤立的胎儿隔离。，选择了源自车身墙的MEF。为了观察以这种方式建立的第一代培养系统的运行特性，使用改进的Dunn驾驶室和一个自动显微镜的多动射击场建立的高坡度观察系统。此外，RT-PCR证实了Cdc42亚家族（CDC42，TC10，TCL，CHP）和RAC亚家族（RAC Sub-Family）（Rac1,2，3和Rhog）的GTP在MEF和单身中表达cDNA。优化RNA干扰方法是为了分析这些分子的作用和功能补充。目前，已经观察到，用Cdc42撞倒的MEF表现出长长的形式，并在细胞体的收缩中表现出较长的形式，并且在运行中显示部分异常。但是，有人提出，运行特性的更新是，信号机理与CDC42信号不同，Cdc42信号迄今为止很重要，它控制着纤维芽的运行特性。将来，我们优化了小脑颗粒中的RNA干扰方法，以便Cdc42子属性可以比较细胞中两个细胞系统的作用。