Identification of an endogenous AhR ligand and charcetrization of its mode of action

内源性 AhR 配体的鉴定及其作用模式的表征

基本信息

批准号：
22K19402
负责人：
成宮周
金额：
$ 4.16万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

Aryl hydrocarbon receptor (AhR)は、dioxinやbenzpyreneなど芳香族炭化水素の受容体で、これらで活性化され、核に転移、チトクローム P450 などを誘導してこれらの代謝を促進する。AhRの働きは、dioxinの毒性発揮、benzopyreneの発がん性誘導、環境汚染物質による炎症惹起など生体に有害なことが多いが、これらはAhRの異物センサーとしての働きであり、遺伝子欠損マウスの解析からは、AhRが発生、細胞分化、抗炎症、免疫、生殖などに働くことが示されている。しかし、AhRがどのような内因性物質で活性化されこれらに働くのかは不明である。本研究の目的は、我々が培養ヒト表皮角化細胞（NHEK)の分化過程で見出した内因性のAhR活性化物質を同定し、その生理活性と発現メカニズムを解明することである。本年度は以下の研究を行った。1.チトクロームp450(CYP1A1)及び表皮角化細胞でAhR依存性に誘導されることが知られているfillagrin (FLG)の発現を指標にNHEK細胞を用いてAhR活性化物質を検出するassay系を確立した。２．上記を用いてNHEK細胞ライゼート及び培養上清のAhR活性化物質を検討し、細胞ライゼートのみならず培養上清でAhR活性化物質（CYP1A1及びFLG mRNA 誘導物質)を検出し、これがNHEK 培養にトリプトファン添加で増加することを確認した。また、各種阻害剤を用いることで、この活性がトリプトファンのキヌレニン経路によらないこと、また、IL-4添加と無関係であることを確認した。３. 量的に多い培養上清を用いて、活性をSepPAK C18で抽出、ついで、順相クロマト、逆相クロマトにかけ、活性がいくつかのピークに分かれること、それらの溶出位置を同定した。一部、質量分析にかけたが構造同定には至っていない。

芳基碳氢化合物受体（AHR）是芳香族烃受体，例如二恶英和苯替林，这些受体被这些受体激活，并诱导核和细胞色素P450促进其代谢。 AHR的功能通常对活生物体有害，例如二恶英的毒性，苯二吡啶的致癌性以及由环境污染物引起的炎症诱导。这些充当AHR的异物传感器，对基因缺陷小鼠的分析表明，AHR在发育，细胞分化，抗炎，免疫和繁殖方面起作用。但是，目前尚不清楚内源性物质AHR激活什么并作用于这些。这项研究的目的是鉴定我们在培养的人表皮角化细胞（NHEK）分化过程中发现的内源性AHR激活物质，并阐明其生理活性和表达机制。今年我们进行了以下研究：1。使用fillagrin（FLG）的表达建立了一种测定系统，以检测使用NHEK细胞的AHR激活物质，该表达已知在细胞色素P450（CYP1A1）中依赖于AHR依赖性AHR诱导，并作为指标表皮角化细胞作为指标。 2。使用上述，检查了NHEK细胞裂解物和培养上清液中的AHR激活剂，并不仅在细胞裂解物中，而且在培养的上清液中还检测到AHR激活剂（CYP1A1和FLG mRNA诱导剂），并确认当斑疹生po添加到NHEK培养中时会增加。此外，通过使用各种抑制剂，可以证实该活性不依赖于色氨酸的Kynurenine途径，并且与IL-4添加无关。 3。使用定量培养上清液，用Seppak C18提取活性，然后进行正常的相色谱和反相色谱法，以识别分为几个峰及其洗脱位置的活性。一些研究是通过质谱法进行的，但未达到结构鉴定。