神経伝達物質開口放出におけるtomosynの調節機構の解明

阐明 Tomosyn 在神经递质胞吐作用中的调节机制

基本信息

批准号：
15780216
负责人：
初沢清隆
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Fukushima Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15780216/
关键词：
SNARE 開口放出膜融合 syntaxin 神経細胞

项目摘要

神経伝達物質やホルモンなどの開口放出(exocytosis)は、それらを含む小胞が細胞膜と融合(fusion)することで達成される。近年、融合装置の基本コンポーネント(SNAREタンパク質;小胞側のsynaptobrevinと細胞膜側のsyntaxinとSNAP-25)が明らかになった。tomosynは、syntaxin結合タンパク質として同定されたSNARE複合体の形成を調節する因子の1つで、私たちの研究から、Ca^<2+>やジアシルグリセロールによって細胞膜への結合が調節されていると考えられた。そこで、tomosynを直接制御する因子を明らかにするために全長tomosynをbaitにし、酵母two-hybrid法を用いてスクリーニングを行った。ヒト脳cDNAライブラリーから、一次スクリーニングで複数のクローンを得た。そのうち二次スクリーニングで比較的強い結合活性を示したものは、カルシウム結合蛋白質として報告のあったsorcinをコードするサイズの異なるクローンが3つ、機能のわかっていないKIAA0737が1クローンだった。これらをtomosynと異なったタグを付加させて培養細胞で共発現し、免疫沈降実験により細胞内での結合を調べたところ、この系では特異的な相互作用は検出できなかった。しかし、sorcinがtomosynとCa^<2+>シグナルを結ぶ因子である可能性が考えられるため、現在クロスリンク試薬を用いた細胞内の相互作用の解析、および全長sorcinをGSTとの融合蛋白質として精製しin vitroでの結合実験を進めている。

当囊泡与细胞膜融合时，可以实现神经递质和激素的胞吐作用。最近，已经揭示了融合装置的基本成分（SNARE蛋白；在囊泡侧的突触纤维和细胞膜侧和SNAP-25上的语法素）的基本成分。 tomosyn是调节被鉴定为义话素结合蛋白的SNARE复合物形成的因素之一，我们的研究表明，与细胞膜结合受CA^<2+>和二酰基甘油的调节。因此，为了阐明直接调节tomosyn的因素，全长的tomosyn被诱饵并使用酵母两杂交方法进行筛选。通过初级筛选从人脑cDNA文库中获得多个克隆。其中，在次级筛选期间表现出相对强的结合活性的是三个编码sorcin的不同大小的克隆，这些克隆被报道为钙结合蛋白，一个克隆是KIAA0737，其功能尚不清楚。这些通过添加不同的标签tomosyn在培养的细胞中共表达，当通过免疫沉淀实验细胞内检查结合时，在该系统中无法检测到特定的相互作用。但是，sorcin可能是连接tomosyn和Ca^<2+>信号的因素，因此我们目前正在使用交联试剂进行体外结合实验，以分析细胞内的相互作用，并将全长sorcin纯化为与GST的融合蛋白。