LAPosomeの形成と成熟化の分子機構を明らかにする

阐明 LAPosome 形成和成熟的分子机制

基本信息

批准号：
20K06641
负责人：
初沢清隆
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Tottori University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

LC3-associated phagocytosis (LAP)において、LC3が局在するLAPosomeは、内部の成熟反応が亢進するがその機構は不明な点が多い。これまでに樹立したLAP関連因子MORN2を過剰発現するLAPosome形成効率の高いマクロファージ（MΦ-MORN2）株を用いて、本研究ではSNARE蛋白質SNAP-23に着目し、MORN2やLC3との関連を解析し「LAPosomeの形成と成熟化の分子機構」を明らかにすることを目的とした。令和4年度は、昨年度に引き続き計画②「MORN2とSNAP-23の機能的相互作用の解明」および計画③「LC3とSNAP-23の機能的相互作用の解明」を行った。細胞の状態が悪くなったため、新たにGFP-MORN2とMyc-ALFA-SNAP23を共発現するMΦ株を樹立した。SNAP23は野生型、リン酸化型、非リン酸化型それぞれを発現させた。その結果、SNAP23のリン酸化状態はLAPosome形成効率に影響しなかった。つまり、LC3のphagosome局在化後にSNAP23のリン酸が起こる可能性が考えられた。また、これらの細胞を用いた免疫沈降では、MORN2とLC3についてSNAP23との相互作用は検出できなかった。現在、LC3の膜局在を誘導しSNAP23との相互作用も報告されているAtg16L1について、phagosome膜上でのSNAP23とLC3との共局在のタイミングと相互作用について検証を進めている。さらに、MORN2と相互作用する因子の網羅的解析を行った。mVenus-ALFAとmVenus-ALFA-MORN2をそれぞれ安定発現するMΦ株を樹立し、anti-ALFA nanobodyを用いて免疫沈降した。それぞれの細胞は、zymosanの有無でphagocytosisを誘導した後に回収し、その抽出液を免疫沈降に用いた。免疫沈降物について、研究協力者の福島県立医大・和田教授に質量分析を依頼した。その結果、MORN2と相互作用する因子としてPI4Kα (phosphatidylinositol 4-kinase α)を見出した。現在、クローニングしたPI4KαとMORN2をHEK293T細胞に一過的に発現させ、相互作用を解析している。

在LC3相关吞噬作用（LAP）中，LC3定位的LAPosome的内部成熟反应加速，但其机制很大程度上未知。本研究利用先前建立的过度表达LAP相关因子MORN2并具有高LAPosome形成效率的巨噬细胞菌株（MΦ-MORN2），重点关注SNARE蛋白SNAP-23，并分析其与MORN2和LC3的关系。目的是阐明“LAPosome形成和成熟的分子机制”。 2020年度，继去年之后，我们实施了计划2：“阐明MORN2和SNAP-23之间的功能相互作用”和计划3：“阐明LC3和SNAP-23之间的功能相互作用”。随着细胞状况恶化，我们建立了一种新的 MΦ 菌株，共表达 GFP-MORN2 和 Myc-ALFA-SNAP23。 SNAP23表达为野生型、磷酸化型和非磷酸化型。因此，SNAP23 的磷酸化状态不会影响 LAPosome 的形成效率。换句话说，认为SNAP23的磷酸化可能发生在LC3的吞噬体定位之后。此外，在使用这些细胞的免疫沉淀中，没有检测到 MORN2 和 LC3 与 SNAP23 的相互作用。我们目前正在研究 SNAP23 和 LC3 在吞噬体膜上的共定位和相互作用的时间，关于 Atg16L1，它诱导 LC3 的膜定位，并且也有报道与 SNAP23 相互作用。此外，我们对与 MORN2 相互作用的因素进行了全面分析。建立稳定表达 mVenus-ALFA 和 mVenus-ALFA-MORN2 的 MΦ 菌株，并使用抗 ALFA 纳米抗体进行免疫沉淀。在存在或不存在酵母聚糖的情况下诱导吞噬作用后收获每个细胞，并将提取物用于免疫沉淀。我们要求我们的研究合作者、福岛医科大学的和田教授对免疫沉淀物进行质谱分析。结果，我们发现 PI4Kα（磷脂酰肌醇 4-激酶 α）是与 MORN2 相互作用的因子。目前，我们正在 HEK293T 细胞中瞬时表达克隆的 PI4Kα 和 MORN2，并分析它们的相互作用。

项目成果

期刊论文数量（6）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Characterization of MORN2 stability and regulatory function in LC3-associated phagocytosis in macrophages

MORN2 稳定性和巨噬细胞 LC3 相关吞噬作用调节功能的表征

DOI：
10.1242/bio.051029
发表时间：
2020
期刊：
Biol Open.
影响因子：
0
作者：
Maya Morita;Mayu Kajiye;Chiye Sakurai;Shuichi Kubo;Miki Takahashi;Daiki Kinoshita;Naohiro Hori;Kiyotaka Hatsuzawa
通讯作者：
Kiyotaka Hatsuzawa

ファゴサイトーシスにおけるSNAP-23リン酸化の機能は受容体依存的である

SNAP-23 磷酸化在吞噬作用中的功能是受体依赖性的