シグナルペプチドの構造と小胞体膜透過における機能の解明

阐明信号肽的结构及其在内质网膜渗透中的功能

基本信息

批准号：
08760319
负责人：
初沢清隆
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Tokyo University of Pharmacy and Life Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

前駆体蛋白質のER膜透過はシグナルペプチド(SP)を介して進行する。SPは、アミノ末端の正電荷を含む領域(N領域)、中央部の疎水性領域(H領域)、とカルボキシル末端領域(C領域)の3つの領域から成る。これらSPの構造とその機能について詳細なin vitro解析はほとんど行われていない。そこで、SPの構造とER膜透過における機能を解明するために以下の研究を行った。(1)これまで大腸菌の膜透過実験に用いてきた、H領域を人工的にすべてロイシン((L)n,n=5,7,8,10,12,14,20)に置換した種々のproOmpF-Lppのシグナルペプチド(SP)を、cDNA上で牛プレプロラクチンの成熟体部分につなぎ、モデル蛋白質proOmpF-PL(L-series)を作製した。これらのmRNAをイヌ膵臓小胞体膜存在下、小麦胚芽蛋白質合成系で翻訳し、SPの切断を指標として膜透過効率を調べたところ、Lの数が10で最大になった。(2)次にSPとシグナル認識粒子(SRP)の相互作用について翻訳停止効率を調べたところ、膜透過効率の場合と同様10Lで最大になった。しかし、それ以上数が増えても効率はほとんど変わらなかった。これらから、SPのSRPによる認識と膜内での認識の特異性は若干異なることが示唆された。(3)H領域にロイシンよりも疎水性の弱いアラニンも含む配列にしたモデル蛋白質proOmpF-PL(AL-series)を構築し同様の実験を行った。膜透過効率、SRPとの相互作用共にL-seriesの結果と似ていたが、最大効率は12ALあるいは14ALで得られ、要求される長さは長くなった。つまり、シグナルペプチドの疎水領域はその長さというより全体の疎水性度がSRPとの相互作用とそれに引き続く膜透過反応に重要であることが明らかになった。

前体蛋白通过 ER 膜的渗透通过信号肽 (SP) 进行。 SP由三个区域组成：氨基末端的带正电区域（N区域）、中心的疏水区域（H区域）和羧基末端区域（C区域）。这些 SP 的结构和功能的详细体外分析几乎尚未进行。因此，我们进行了以下研究来阐明SP的结构及其在ER膜渗透中的功能。 (1) 已用于大肠杆菌膜渗透实验的各类细胞，其H区全部人工替换为亮氨酸((L)n,n=5,7,8,10,12,14,20 ) 将 proOmpF-Lpp 的信号肽 (SP) 与 cDNA 上牛催乳素前体的成熟部分连接，创建模型蛋白 proOmpF-PL（L 系列）。在犬胰腺内质网膜存在的情况下，使用小麦胚芽蛋白合成系统翻译这些mRNA，并以SP裂解为指标检查膜渗透效率。L数最大为10。 (2) 接下来，我们研究了 SP 与信号识别颗粒 (SRP) 之间相互作用的翻译终止效率，发现其在 10 L 时达到最大值，与膜渗透效率类似。然而，即使数量进一步增加，效率也几乎保持不变。这些结果表明SRP对SP的识别特异性与膜内识别略有不同。 (3)我们构建了模型蛋白proOmpF-PL（AL系列），其H区含有丙氨酸（其疏水性比亮氨酸低），并进行了类似的实验。膜渗透效率和与SRP的相互作用均与L系列结果相似，但12AL或14AL获得最大效率，并且所需长度更长。换句话说，我们已经清楚信号肽疏水区的整体疏水性（而不是其长度）对于与 SRP 的相互作用以及随后的膜渗透反应很重要。