モデル前駆体蛋白質を用いた小胞体膜透過の分子機構の解明

使用模型前体蛋白阐明内质网膜渗透的分子机制

• 批准号: 06760300
• 负责人: 初沢 清隆
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Tokyo University of Pharmacy and Life Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06760300/
• 关键词: 膜透過; 小胞体; シグナル認識粒子; モデル前駆体蛋白質

細胞内で合成される蛋白質の多くは、リボソーム上での合成にともない、膜透過システムを経て、細胞外に分泌されたり、あるいは細胞内のオルガネラへ局在化する。一般に、分泌型蛋白質の膜透過は原核細胞では細胞膜系、動物細胞では小胞体(ER)膜系をとおして行われ、両者は基本的に同じ機構で膜透過すると考えられている。そこで今年度は、当研究室の大腸菌での膜透過機構の成果をもとに、動物細胞小胞体膜透過の分子機構を解明するために以下の研究を行った。1)大腸菌モデル前駆体蛋白質を用いた膜透過実験を行うにあたり、コムギ胚芽抽出液(WG)によるin vitro蛋白質合成系を見直し、合成の最適条件を決定した。また、膜(イヌ膵臓ミクロソーム画分)透過の律速になるSRP(シグナル認識粒子)を完全精製した。これらを用いて、初めにプレプロラクチンの効率の良い透過システムを確立した。2)この透過システムを用い、大腸菌モデル前駆体蛋白質proOmpF-Lpp,proOmpA及びproOmpA-D26について調べたところ、proOmpAは効率よく膜透過したがその他はプロテアーゼ耐性が見られず、膜透過しなかった。proOmpF-Lpp,proOmpA-D26は、約80アミノ酸残基から成るためSRPに認識される前にリボソームから遊離してしまい、膜にターゲティングできなかったと思われる。今年度はSRPなどの準備、精製に多大な時間がかかってしまい当初の目的に沿った研究成果はあまり得られなかった。現在、前駆体蛋白質の長さを考慮し、proOmpFのpro部分をプロラクチンのN末端につないだキメラ蛋白質(191アミノ酸残基)を作製し膜透過を調べている。

细胞内合成的许多蛋白质在核糖体上合成时被分泌到细胞外或通过膜渗透系统定位到细胞内的细胞器。一般认为，分泌蛋白的膜渗透通过原核细胞的细胞膜系统和动物细胞的内质网(ER)膜系统发生，并且两种膜渗透通过基本相同的机制发生。因此，今年，我们基于实验室对大肠杆菌膜渗透机制的研究成果，开展了以下研究，以阐明动物细胞内质网膜渗透的分子机制。 1）在使用大肠杆菌模型前体蛋白进行膜渗透实验时，我们回顾了使用小麦胚芽提取物（WG）的体外蛋白质合成系统，并确定了最佳合成条件。此外，我们完全纯化了 SRP（信号识别颗粒），它是膜（犬胰腺微粒体部分）渗透的限速剂。利用这些，我们首先建立了前催乳素的有效渗透系统。 2）利用该渗透系统，我们研究了大肠杆菌模型前体蛋白proOmpF-Lpp、proOmpA和proOmpA-D26，发现proOmpA能够有效地渗透膜，但其他蛋白没有表现出蛋白酶抗性并且没有渗透膜。由于proOmpF-Lpp和proOmpA-D26由约80个氨基酸残基组成，它们很可能在被SRP识别之前从核糖体中释放，因此不能靶向膜。今年，我们花了很多时间来准备和纯化SRP，因此没有能够获得很多符合我们最初目标的研究成果。目前，考虑到前体蛋白的长度，我们正在构建一种嵌合蛋白（191个氨基酸残基），其中proOmpF的pro部分连接到催乳素的N末端，并研究膜渗透。