小胞体に局在するSyntaxin17の細胞内機能の解明

阐明位于内质网的 Syntaxin17 的细胞内功能

• 批准号: 11760225
• 负责人: 初沢 清隆
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Tokyo University of Pharmacy and Life Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11760225/
• 关键词: 小胞輸送; syntaxin; SNARE; 小胞体; ゴルジ体

私達が最近発見したsyltaxin17(syn17)は、SNAREs(soluble NSF attachment protein receptors)の一つで、小胞体に局在することから蛋白質の小胞輸送に機能することが予想された。そこで本年度は、syn17の小胞体-ゴルジ体間における機能をsyn5(シスゴルジ体に局在)と比較しながら解析した。(1)syn17の過剰発現によるドミナントネガティブ効果i)小胞輸送に機能する蛋白質を培養細胞で過剰発現させるとオルガネラの構造が小胞化し細胞内に分散することが知られている。そこで、syn17を動物培養細胞で発現させたときの小胞体〜ゴルジ体中間区画(ERGIC)〜ゴルジ体の形態を間接蛍光抗体法で調べた。また、コントロールとしてsyn5についても同様に調べた。syn17とsyn5ともに過剰発現によってゴルジ体は分散していた。一方、ERGICはsyn5では変化なかったがsyn17では分散していた。ii)小胞体からの蛋白質輸送への影響。syn17およびsyn5を過剰発現させた細胞における小胞体からの蛋白質の輸送を観察したところ、syn17の場合蛋白質は小胞体にとどまったままで輸送されていなかった。一方、syn5の場合は小胞体からの輸送は正常に起こりsyn5と同じ局在を示した。syn17の過剰発現によって、ゴルジ体から小胞体への輸送が阻害されることにより全体の膜系のバランスが壊れた結果と考えられた。(2)抗syn17抗体を用いた免疫沈降実験ラット肝臓の全膜画分を可溶化し、抗syn17抗体による免疫沈降実験を行い、小胞体-ゴルジ体間のSNAREs(Sec22b,membrinとrbet1p)との相互作用を各抗体でウエスタンプロット法により調べた。抗syn5抗体で免疫沈降を行ったところ、以前の報告通りSec22b,membrinとrbet1ともに結合していたが、syn17はSec22bのみと結合していた。これは、syn17が機能する際にsyn5とは異なった複合体を形成することを示唆するものである。以上の結果から、syn17が小胞体-ゴルジ体の小胞輸送に関与すること、またsyn5とは異なったステップで機能することが明らかになった。

我们最近发现的 Syltaxin17 (syn17) 是 SNARE（可溶性 NSF 附着蛋白受体）之一，由于它定位于内质网，因此有望在蛋白质的囊泡运输中发挥作用。因此，今年我们分析了syn17在内质网和高尔基体之间的功能，并将其与syn5（定位于顺式高尔基体）进行了比较。 (1)syn17过表达引起的显性负效应i)已知当在囊泡运输中起作用的蛋白质在培养细胞中过表达时，细胞器结构变成囊泡状并分散在细胞内。因此，当syn17在培养的动物细胞中表达时，利用间接荧光抗体方法研究了内质网-高尔基体中间室（ERGIC）和高尔基体的形态。另外，作为对照，syn5也同样地进行了研究。由于 syn17 和 syn5 的过度表达，高尔基体被分散。另一方面，ERGIC在syn5中没有变化，但在syn17中分散。 ii) 对内质网蛋白质转运的影响。当我们观察过表达syn17和syn5的细胞中蛋白质从内质网的转运时，我们发现在syn17的情况下，蛋白质保留在内质网中并且没有被转运。另一方面，在syn5的情况下，来自内质网的转运正常发生并且显示出与syn5相同的定位。人们认为 syn17 的过度表达通过抑制从高尔基体到内质网的转运来破坏整个膜系统的平衡。 (2)使用抗syn17抗体的免疫沉淀实验将大鼠肝脏的全膜级分溶解，使用抗syn17抗体进行免疫沉淀实验，通过Western blotting研究各抗体的相互作用。使用抗 syn5 抗体进行免疫沉淀显示，Sec22b、membrin 和 rbet1 如先前报道的那样结合在一起，但 syn17 仅与 Sec22b 结合。这表明syn17在发挥作用时形成了与syn5不同的复合体。这些结果表明，syn17 参与内质网和高尔基体之间的囊泡转运，并且其功能步骤与 syn5 不同。