ゼブラフィッシュの挿入変異生成法による脊椎動物初期発生研究

利用斑马鱼插入诱变进行早期脊椎动物发育研究

• 批准号: 02F00793
• 负责人: 川上 浩一
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: National Institute of Genetics
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02F00793/
• 关键词: 分子生物学; 発生遺伝学; ゼブラフィッシュ; トランスポゾン; 挿入変異; 転移酵素; 遺伝子トラップ; トランスジェニック動物

メダカトランスポゾンTol2因子を用いて、ゼブラフィッシュにおいて遺伝子トラップ法を実施し、ゼブラフィッシュの発生を制御する遺伝子の構造と機能を解明することを目的として研究を行った。以下の成果を得た。(1)Tol2因子を基に、スプライスアクセプター部位、リポーター遺伝子であるGFP遺伝子、SV40のポリAシグナルをも遺伝子トラップベクターを構築した。転移酵素をコードするmRNAを試験管内で合成した。この遺伝子トラップベクタープラスミドDNAを転移酵素mRNAとともに、ゼブラフィッシュ受精卵へ微量注入した。(2)微量注入を施されたゼブラフィッシュを成魚に育て、かけあわせにより次世代のゼブラフィッシュ胚を得た。それら次世代ゼブラフィッシュ胚を実体蛍光顕微鏡下で観察することにより、GFPを時空間特異的に発現する遺伝子トラップゼブラフィッシュを多数分離することができた。(3)遺伝子トラップゼブラフィッシュのうちの1つでは、GFPが神経管特異的に発現していた。この遺伝子トラップゼブラフィッシュをかけあわせることにより、単一のトランスポゾン挿入を有するゼブラフィッシュ系統を確立した。サザン解析により、神経管特異的発現の原因となるトランスポゾン挿入を特定することができた。トランスポゾン挿入近傍のゲノムDNAをインバースPCR法によりクローニングし、塩基配列を決定することに成功した。

使用Medaka transposon TOL2因子在斑马鱼中进行基因捕获，并进行研究的目的是阐明控制斑马鱼发育的基因的结构和功能。实现了以下结果：（1）基于TOL2因子，使用剪接受体位点，报告基因GFP基因和SV40的Polya信号构建基因陷阱载体。在体外合成了编码转移酶的mRNA。将此基因陷阱载体质粒DNA与转移酶mRNA一起注入斑马鱼受精卵中。 （2）将斑马鱼生长到成年鱼中，并通过将它们结合来获得下一代斑马鱼胚胎。通过观察到体内荧光显微镜下的这些下一代斑马鱼胚胎，可以专门分离出许多表达GFP的基因捕获的斑马鱼。 （3）在一种基因捕获的斑马鱼中，GFP在神经管中专门表达。通过结合这种基因捕获斑马鱼，建立了带有单个转座子插入的斑马鱼线。南方分析使我们能够鉴定出负责神经管特异性表达的转座子插入。转座子插入附近的基因组DNA通过反PCR克隆，并成功确定碱基序列。

项目成果

Kawakami, K., Noda, T.: "Transposition of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish Oryzias latipes, in mouse embryonic stem cells."Genetics. 166. 895-899 (2004)

Kawakami, K., Noda, T.：“Tol2 元件（一种来自日本青鳉鱼 Oryzias latipes 的 Ac 样元件）在小鼠胚胎干细胞中的转位。”遗传学。

ClarK, M.S., Edwards, Y.J.K., Peterson, D., Clifton, S.W., Thompson, A.J., Sasaki, M., Suzuki, Y., Kikuchi, K., Watabe, S., Kawakami, K., Sugano.S., Elgar, G., Johnson, S.L.: "Fugu ESTs : New resources for transcription analysis and genome annotation."Gen

克拉克，M.S.，爱德华兹，Y.J.K.，彼得森，D.，克利夫顿，S.W.，汤普森，A.J.，佐佐木，M.，铃木，Y.，菊池，K.，渡边，S.，川上，K.，菅野.S.

Terai, Y., Morikawa, N., Kawakami, K., Okada, N.: "The complexity of alternative splicing of hagoromo mRNAs is increased in an explosively speciated lineage in East African cichlids."Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 100. 12798-12803 (2003)

Terai, Y.、Morikawa, N.、Kawakami, K.、Okada, N.：“在东非丽鱼科鱼的爆炸性物种谱系中，hagoromo mRNA 选择性剪接的复杂性增加。”Proc.Natl.Acad.Sci。