ゼブラフィッシュの挿入変異生成法による脊椎動物遺伝子の機能解析

使用斑马鱼插入诱变方法进行脊椎动物基因的功能分析

• 批准号: 15011256
• 负责人: 川上 浩一
• 金额: $ 3.84万
• 依托单位: National Institute of Genetics
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15011256/
• 关键词: 分子生物学; 発生遺伝学; ゼブラフィッシュ; トランスポゾン; 挿入変異; 転移酵素; 遺伝子トラップ; トランスジェニック動物; 分子生物学; 発生遺伝学; ゼブラフィッシュ; トランスポゾン; 挿入変異; 転移酵素; 遺伝子トラップ; トランスジェニック動物

(1)メダカトランスポゾンTol2因子を基に、スプライスアクセプター部位、リポーター遺伝子であるGFP遺伝子、SV40のポリAシグナルをも遺伝子トラップベクターを構築した。転移酵素をコードするmRNAを試験管内で合成した。この遺伝子トラップベクタープラスミドDNAを転移酵素mRNAとともに、ゼブラフィッシュ受精卵へ微量注入した。(2)微量注入を施されたゼブラフィッシュを成魚に育て、かけあわせにより次世代のゼブラフィッシュ胚を得た。それら次世代ゼブラフィッシュ胚を実体蛍光顕微鏡下で観察することにより、GFPを時空間特異的に発現する遺伝子トラップゼブラフィッシュを多数分離することができた。(3)遺伝子トラップゼブラフィッシュのうちの1つでは、GFPが体節特異的に発現していた。この遺伝子トラップゼブラフィッシュをかけあわせることにより、単一のトランスポゾン挿入を有するゼブラフィッシュ系統を確立した。サザン解析により、体節特異的発現の原因となるトランスポゾン挿入を特定することができた。トランスポゾン挿入近傍のゲノムDNAをインバースPCR法によりクローニングし、塩基配列を決定し、トランスポゾンがhoxcクラスターに挿入されていることを明らかにした。5'RACE法によりhoxc3a遺伝子の転写がトラップされていることを明らかにした。(4)この他に単一のトランスポゾン挿入を有する遺伝子トラップゼブラフィッシュを15系統確立し、インバースPCRによる近傍ゲノムの解析を行った。また、これらのうち7系統について5'RACE法によりトラップされている転写物を明らかにした。

（1）基于MEDAKA转座子TOL2因子，使用剪接受体位点，报告基因GFP基因和SV40的Polya信号构建基因陷阱载体。在体外合成了编码转移酶的mRNA。将此基因陷阱载体质粒DNA与转移酶mRNA一起注入斑马鱼受精卵中。 （2）将斑马鱼生长到成年鱼中，并通过将它们结合来获得下一代斑马鱼胚胎。通过观察到体内荧光显微镜下的这些下一代斑马鱼胚胎，可以专门分离出许多表达GFP的基因捕获的斑马鱼。 （3）GFP在一个受基因捕获的斑马鱼之一中特异性表达。通过结合这种基因捕获斑马鱼，建立了带有单个转座子插入的斑马鱼线。南方分析使我们能够鉴定出负责各个特定表达的转座子插入。基因组DNA在转座子插入附近的基因组DNA通过反PCR克隆，并确定碱基序列，揭示了转座子插入HOXC簇中。 Hoxc3a基因的转录被5'Race方法捕获。 （4）此外，用单个转座子插入建立了15个基因捕获的斑马鱼菌株，并通过反PCR分析了附近的基因组。此外，其中7种菌株揭示了被5'race方法捕获的转录本。