ゼブラフィッシュの挿入変異生成法による脊椎動物遺伝子の機能解析

使用斑马鱼插入诱变方法进行脊椎动物基因的功能分析

• 批准号: 14011207
• 负责人: 川上 浩一
• 金额: $ 4.48万
• 依托单位: National Institute of Genetics
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14011207/
• 关键词: 分子生物学; 発生遺伝学; ゼブラフィッシュ; トランスポゾン; 挿入変異; 初期発生; 遺伝子トラップ; トランスジェニック動物

本研究では、メダカゲノムから同定されたトランスポゾンTol2因子を用いて、モデル脊椎動物である小型魚類ゼブラフィッシュにおける効率のよい挿入変異生成法、遺伝子導入法の開発を目的として研究を行い、以下の成果を得た。また、ゼブラフィッシュレトロウィルス挿入変異hagoromoの原因遺伝子に関する解析を行い、以下の成果を得た。(1)To12因子にゼブラフィッシュSix3.2遺伝子のプロモーターとGFP遺伝子を組み込んだ。このプラスミドDNAを転移酵素をコードするmRNAとともにゼブラフィッシュ受精卵へ微量注入し、次世代においてトランスジェニックフィッシュを同定することに成功した。このトランスジェニックゼブラフィッシュにおいては、前脳、目でGFPを特異的に発現てていた。(2)Tol2因子を基に、スプライスアクセプター部位、リポーター遺伝子であるGFP遺伝子、SV40のポリAシグナルをもつ遺伝子トラップベクターを構築した。このトラップベクタープラスミドDNAを転移酵素をコードするmRNAとともに、ゼブラフィッシュ受精卵へ微量注入した。これらゼブラフィッシュを成魚に育て、かけあわせにより次世代のゼブラフィッシュを得た。それら次世代ゼブラフィッシュを解析することにより、遺伝子トラップ法の実施が可能であることを示した。(3)ゼブラフィッシュhagoromo遺伝子のhomologを東アフリカのカワスズメからクローニングし、カワスズメの種分化にhagoromo遺伝子の進化が関与する可能性を示唆した。

在这项研究中，我们利用从青鳉基因组中鉴定出的转座子Tol2元件，在模式脊椎动物小鱼斑马鱼中开发了一种高效的插入诱变方法和基因转移方法，并取得了以下结果。我们还分析了负责斑马鱼逆转录病毒插入突变hagoromo的基因，并获得了以下结果。 (1)将斑马鱼Six3.2基因和GFP基因的启动子整合到To12元件中。通过将该质粒 DNA 与编码转移酶的 mRNA 一起显微注射到受精斑马鱼卵中，我们成功地鉴定了下一代转基因鱼。在这种转基因斑马鱼中，GFP 在前脑和眼睛中特异性表达。 (2)基于具有剪接受体位点的Tol2元件、报告基因GFP基因和SV40的polyA信号构建基因捕获载体。将此捕获载体质粒 DNA 与编码转移酶的 mRNA 一起显微注射到受精斑马鱼卵中。这些斑马鱼被饲养到成年，并通过杂交获得下一代斑马鱼。通过分析这些下一代斑马鱼，我们证明了基因捕获方法是可能的。 (3)从东非慈鲷中克隆了斑马鱼hagoromo基因的同源物，表明hagoromo基因的进化可能参与了慈鲷的物种形成。

项目成果

Terai, Y., Morikawa, N., Kawakami, K., Okada, N.: "Accelerated evolution of the surface amino acids in the WD-repeat domain encoded by the hagoromo gene in an explosively speciated lineage of east African cichlid fishes"Molecular Biology and Evolution. 19

Terai, Y.、Morikawa, N.、Kawakami, K.、Okada, N.：“在东非丽鱼科鱼的爆炸性物种谱系中，由 hagoromo 基因编码的 WD 重复结构域中表面氨基酸的加速进化”