予定外胚葉領域由来全能性幹(ES)細胞からの歯牙の誘導とその組織再生医療への応用

预期外胚层区域的全能干细胞诱导牙齿及其在组织再生医学中的应用

基本信息

批准号：
13877341
负责人：
岡本哲治
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

アクチビンAは,TGF-βfamilyに属しアフリカツメガエル(Xenopus)において中胚葉誘導能を示すことが報告されて以来,代表的な分化誘導因子として認識されている。我々は,in vitroにおいてXenopus胞胚期予定外胚葉片(アニマルキャップ)をアクチビンA存在下で培養(アニマルキャップアッセイ;ACA)すると濃度依存的に血球,筋肉,脊索や心臓,膵臓などの中胚葉組織が誘導されること,また,アクチビンAにて定時間前処理したアニマルキャップを,アクチビンA未処理のアニマルキャップ二枚で挟み込むSandwich culture(SC)では,アクチビンAの前処理時間に依存して,頭部から胴尾部の組織が誘導されることをすでに報告した。また,ACA-SCによりアルシアンブルー陽性軟骨様原基が誘導されることを報告した。今回我々は,ACA-SCにより誘導されたアルシアンブルー陽性軟骨様原基をRT-PCR, insitu hybridization(ISH),免疫組織染色を用いてさらに検討した。[方法]ACA-SCをそれぞれ2,4,7,10,14日間行ったexplant組織からRNAを抽出し,type 1 collagen(coll 1),type2 collagen(coll 2),Xenopus Distal-less4(Xdll 4),cartilage homeo-protein 1(car 1)の発現をRT-PCRにて検討した。また,Nieuwkoop and Faber Stage(St.)22〜28,36,41のXenopus embryoを頭部,胴尾部に切断後,RNAを抽出し上記遺伝子の発現をRT-PCRにて検討した。さらに,4,7,10日間培養したexplantのcoll 2,car 1の局在をISHにて,また,coll 2の局在を免疫組織染色にて検討しXenopus embryoの各Stageと比較した。[結果と考察]coll 1,2は2〜14日間培養したexlpantにおいて発現を認めた。embryoでは,St.22〜28以降に強く発現していた。Xdll 4は,explantでは2〜14日間培養したもので発現を認め,embryoではSt.22〜28以降の頭部のみで発現を認めた。car 1は,explantでは,その発現は2,3日間培養したもので弱く,4〜10日間培養したもので強く発現していた。embryoでは,St.22〜28の頭部で弱い発現を認めSt.36,41において強く発現していた。またISHにおいては,coll 2,car 1ともに4,7日間培養したexplantの軟骨原基に限局して発現を認めたが,10日間では発現が消失した。さらに,免疫組織染色において,4,7,10日間培養したexplantの軟骨原基におけるcoll 2の発現は,それぞれSt.40,42,44の鰓弓軟骨におけるcoll 2の発現に類似した像を示した。以上の結果から,in vitroにおいて予定外胚葉領域未分化細胞からアニマルキャップアッセイにより誘導された軟骨組織は頭部軟骨組織である可能性が強く考えられた。

激活素 A 属于 TGF-β 家族，自从报道其在非洲爪蟾中表现出中胚层诱导能力以来，已被认为是代表性的分化诱导因子。当非洲爪蟾囊胚期外胚层碎片（动物帽）在激活素 A（动物帽测定；ACA）存在下进行体外培养时，我们发现血细胞、肌肉、脊索、中胚层组织如心脏、胰腺等。另外，将经过激活素A预处理一定时间的动物帽夹在两个未经激活素A处理的动物帽之间。我们已经报道过，在培养（SC）中，根据激活素 A 的预处理时间，从头部到躯干和尾部的组织被诱导。我们还报道了 ACA-SC 诱导了阿尔新蓝阳性的软骨样原基。在这里，我们使用 RT-PCR、原位杂交 (ISH) 和免疫组织学染色进一步研究了 ACA-SC 诱导的阿尔新蓝阳性软骨样原基。 [方法] 分别从ACA-SC处理2、4、7、10和14天的外植体组织中提取RNA，并提取1型胶原（coll 1）、2型胶原（coll 2）、Xenopus Distal-less4 (Xdll 4) )，通过 RT-PCR 检查软骨同源蛋白 1 (car 1) 的表达。另外，将Nieuwkoop和Faber Stage(St.)22-28、36和41的非洲爪蟾胚胎切割成头部、身体和尾部后，提取RNA并通过RT-PCR检查上述基因的表达。此外，通过ISH检查培养4、7和10天的外植体中coll 2和car 1的定位，通过免疫组织学染色检查coll 2的定位，并与爪蟾胚胎的各个阶段进行比较。 [结果与讨论] 在培养2至14天的外植体中观察到coll 1和2的表达。在胚胎中，它在St.22-28之后强烈表达。 Xdll 4在培养2至14天的外植体中表达，并且在胚胎中，仅在第22至28期以后的头部中观察到表达。 Car 1在培养2或3天的外植体中弱表达，在培养4至10天的外植体中强表达。在胚胎中，在St.22-28的头部观察到弱表达，在St.36和41中观察到强表达。此外，在ISH中，在培养4天和7天的外植体的软骨原基中局部观察到coll 2和car 1的表达，但表达在10天后消失。此外，免疫组化染色显示，培养4、7和10天的外植体软骨原基中coll 2的表达量分别与St.40、42和44的鳃弓软骨中coll 2的表达量相似。塔。从以上结果来看，通过动物帽试验从预期外胚层区域的未分化细胞体外诱导的软骨组织很可能是头部软骨组织。