無血清再集合培養系を用いたマウスES及びヒト骨髄間葉系幹細胞からの顎骨・歯胚誘導

使用无血清再增殖培养系统诱导小鼠 ES 和人骨髓间充质干细胞的颌骨和牙胚

基本信息

批准号：
18659598
负责人：
岡本哲治
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

1.19年度の研究成果:ヒト骨髄由来幹細胞(HBMSC)の未分化性を長期に維持する無血清培養条件を確立した。方法:骨折あるいは顎変形症手術時に患者よりインフォームドコンセントを行い、承諾書を得た後、顎骨より骨髄細胞を採取した。我々がすでに報告した、マウス胚性幹(ES)細胞の未分化性と多分化能を維持可能な無血清培地ESF7培地を基礎培地として、種々の因子の添加し、HBMSCの未分化状態を維持する培養条件を検討した。結果:ESF7培地にFGF-2を加えることによりHBMSCの長期無血清培養が可能であることが明らかとなった。また、同培地を用いることにより10代以上に渡って継代培養が可能であった。未分化マーカーであるSH-1,-2,CD13,34,49,117,140の発現を、これらの抗体を用いて免疫組織学的解析法ならびにFlow cytometory(現有備品)により検討した結果、これらマーカータンパクを発現していた。また、nanog,やアルカリフォスファターゼ活性も長期にわたり陽性を示した。2.ヒト骨髄幹細胞から位置情報をもつ骨の誘導条件を確立した。上記で決定した無血清培養条件下に,未分化な骨髄幹細胞に、nodal,BMP2,4,7,FGF-1,2,7,10を添加し、スミロン・スフェロイドプレートに播種してスフェロイドを形成させ、10日間培養を行い、4%パラフォルムアルデヒドで固定、あるいは、RNAを抽出し、組織学的検討及びDNAマイクロアレイ解析を行った結果、nodal、およびBMP4により顎顔面の位置情報を示す遺伝子発現を認めた。未分化な骨髄幹細胞をnodal、あるいはBMP4,で処理した細胞群を混合し、スミロン・スフェロイドプレートに播種してスフェロイドを形成させ、10日間培養を行い、組織学的検討およびRNAを抽出した。4%パラフォルムアルデヒドで固定したスフェロイドのパラフィン切片を作製し、組織学染色(HE染色、アルシアンブルー・PAS二重染色、アニザリンレッド染色)を行い、誘導される組織を解析した。遺伝子発現の解析結果:骨・軟骨のマーカー遺伝子であるRunx2,Sox5,6,9,オステオネクチン,オステオポンチン。頭部マーカー遺伝子であるOTX-2,Msx1,Msx2,goosecoide,顎顔面領域特異的遺伝子であるHoxa2,Distal-less 1-4,Neural crestマーカー遺伝子であるAP2,Snail,Twist、歯のマーカー遺伝子であるアメロジェニン遺伝子の発現を認めた。

1. 2019年研究成果：建立了长期维持人骨髓源性干细胞（HBMSCs）未分化状态的无血清培养条件。方法：在骨折或颌畸形手术时获得患者知情同意后，从颌骨中采集骨髓细胞。使用ESF7培养基，我们之前报道的一种无血清培养基，可以维持小鼠胚胎干（ES）细胞的未分化状态和多能性，作为基础培养基，添加各种因子来维持HBMSC的未分化状态。文化条件。结果：结果表明，通过在ESF7培养基中添加FGF-2，可以实现HBMSCs的长期无血清培养。此外，通过使用相同的培养基，可以继代培养10代以上。使用这些抗体，通过免疫组织学分析和流式细胞术（现有设备）检查未分化标记物SH-1,-2, CD13,34,49,117,140的表达，结果发现这些标记物蛋白质被表达。 Nanog和碱性磷酸酶活性在很长一段时间内也显示出积极的结果。 2.我们利用人类骨髓干细胞的位置信息建立了诱导骨的条件。在上述确定的无血清培养条件下，将nodal、BMP2、4、7、FGF-1、2、7、10添加到未分化的骨髓干细胞中，并将其接种到苏米龙球体平板上形成球体并培养。 10天用4%多聚甲醛固定或提取RNA后，组织学检查和DNA微阵列分析揭示了通过节点和BMP4指示颌面部位置信息的基因表达。将经过Nodal或BMP4处理的一组未分化骨髓干细胞混合，接种到Sumilon球体平板上形成球体，培养10天，然后进行组织学检查和RNA提取。制备用4%多聚甲醛固定的球状体的石蜡切片，进行组织学染色（HE染色、阿尔新蓝/PAS双染色、茴香红染色），并对诱导的组织进行分析。基因表达分析结果：骨/软骨标志基因Runx2、Sox5、6、9、骨连接蛋白、骨桥蛋白。观察头部标记基因OTX-2、Msx1、Msx2、goosecoide、颌面部区域特异性基因Hoxa2、Distal-less 1-4、神经嵴标记基因AP2、Snail、Twist和牙齿标记基因某牙釉蛋白基因的表达。。