予定外胚葉領域由来全能性幹(ES)細胞からの歯牙の誘導とその組織再生医療への応用

预期外胚层区域的全能干细胞诱导牙齿及其在组织再生医学中的应用

基本信息

批准号：
14657525
负责人：
岡本哲治
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14657525/
关键词：
アフリカツメガエル胚未分化細胞 activin A 顎顔面諸器官遺伝子発現器官形成歯胚眼球様構造アクチビンA アフリカツメガエル(Xenopus)アニマルキャップアッセイ予定外胚葉領域未分化細胞コラーゲン遺伝子発現アルシアンブルー陽性軟骨様原基頭部軟骨組織 cartilage homeo-protein 1

项目摘要

本研究計画では,顎顔面領域の軟骨をより効率的に誘導し,歯や眼などの顎顔面諸器官をも誘導させることをめざし,アフリカツメガエル胚未分化細胞再集合培養系を用いて以下の検討を行った.アニマルキャップ(AC)をCa^<2+>,Mg^<2+>を含まないSteinberg's solution(SS)中で細胞解離後,activin A(25ng/ml)で1時間処理した細胞群とactivin A未処理群を種々の比率で混合し,Ca^<2+>,Mg^<2+>を含むSS中で再集合体を形成し培養後,組織学的解析ならびにRT-PCR法およびin situ hybridization法を用いて各種遺伝子の発現を検討した.また,再集合体を正常胚へ移植し,移植組織を組織学的ならびに分子生物学的に解析した.1.Activin A処理細胞のみから形成した再集合体(Aat再集合体)は,培養期間7日では,組織学的にyork-richな内胚葉組織から構成され,内胚葉組織に発現するendoderminの発現を強く認めた.2.Activin A処理群:未処理群1:1から形成した再集合体は,培養期間7日では,組織学的に主に脊索ならびに筋組織から構成され,Xnotおよび後方脊髄に発現するHoxb9の発現を強く認めた.3.activin A処理群:未処理群1:5から形成した再集合体(1:5再集合体)は,培養期間7日では,組織学的に主に軟骨組織から構成され,顎顔面領域ならびに軟骨に発現するgsc,X-Hoxa2,X-dll4,Sox9,Col2の発現を認めた.in situ hybridization法の結果,培養期間4日目において,gsc,X-dll4,Sox9,Col2の遺伝子発現の局在を認めた.しかし,Hoxb9の発現は認めなかった.4.1:5再集合体を正常胚(st23)下顎相当部へ移植を行ったところ,10日目の同組織は主に軟骨組織によって構成され,1日目,4日目の移植組織でgsc,X-Hoxa2,X-dll4,Sox9,Col2の発現をを認めた.5.1:5再集合体を正常胚(st23)腹部へ移植を行ったところ,10日目の同組織には,軟骨組織,筋組織,神経組織,ならびに眼球様構造を認めgsc,X-Hoxa2,X-dll4,Sox9,Col2の発現を認めた.6.1:5再集合体,下顎相当部移植組織,および腹部移植組織ではPax6の発現は認められなかったが,培養24時間の1:5再集合体,1日目ならびに3日目の腹部移植組織ではその発現を認めた.以上の結果より,再集合培養系を用いてin vitroで未分化細胞から細胞分化ならびに位置情報をコントロールすることができた.位置情報を有した再集合体は,移植後もその情報を持ち続けて機能し,さらに眼球様構造や歯胚,等の顎顔面領域の諸器官の誘導も可能であることが明らかとなった.再集合培養系は,顎顔面領域の発生メカニズムの解明のみならず,再生医療においても有効なモデルとして考えられる.

在这个研究项目中，我们的目标是使用非洲爪蟾胚胎未分化细胞再增殖培养系统更有效地诱导颌面部区域的软骨，并诱导牙齿和眼睛等颌面部器官，以实现以下目标：动物帽（AC）在Ca中解离不含Mg 2+ 的斯坦伯格溶液(SS)，然后用激活素A(25ng/ml)处理细胞组和激活素1小时。将未处理组以不同比例混合以在含有Ca ^ 2+ 、Mg ^ 2+ 的SS中形成重配体。经过培养、组织学分析、RT-PCR和体外研究，我们使用以下方法研究了各种基因的表达。我们还将重组子移植到正常胚胎中，并对移植组织进行组织学和分子学分析。 1．仅由A处理的细胞形成的重配体(Aat重配体)在组织学上由培养7天后富含约克的内胚层组织组成，并在内胚层组织中强烈表达内胚层蛋白。2.激活素。培养7天后，处理组A与未处理组以1:1的比例形成的重配体在组织学上主要由脊索和肌肉组织组成，并强表达Hoxb9，其在Xnot和后脊髓中表达。 3.激活素A处理组:未处理组1:5形成的重配体(1:5重配体)在培养7天后组织学上主要由软骨组织组成，颌面部和软骨有gsc、X-Hoxa2、X的表达。原位观察到-dll4、Sox9 和 Col2。杂交方法的结果是，在培养期的第4天，观察到gsc、X-dll4、Sox9和Col2的基因表达的定位。但是，没有观察到Hoxb9的表达。4. ）移植到下颌骨相应部位时，第10天的组织主要由软骨组织组成，第1天和第4天的移植组织显示gsc、X-Hoxa2、X-dll4、Sox9、Col2。观察到 5.1:5 重配体的表达正常。当胚胎（st23）移植到腹部时，第10天在同一组织中发现软骨组织、肌肉组织、神经组织和眼球样结构，并且GSC、X-Hoxa2、X-dll4、Sox9、观察到Col2表达。6.1:5重配虽然在下颌等效移植组织和腹部移植组织中未观察到Pax6的表达，但在培养24小时后的1:5重配以及第1天和第3天的腹部移植组织中观察到其表达。，使用再群体培养系统我们能够在体外控制未分化细胞的细胞分化和位置信息。具有位置信息的重组细胞即使在移植后也能继续发挥作用并保留这些信息，并进一步发育出眼球样结构、牙胚等。已经清楚的是，再生培养系统不仅可以被认为是阐明颌面部发育机制的有效模型，而且可以作为再生医学的有效模型。