鳥類のZW型性決定機構のゲノム生物学的アプローチによる解析

使用基因组生物学方法分析鸟类 ZW 型性别决定机制

基本信息

批准号：
13206071
负责人：
水野重樹
金额：
$ 3.52万
依托单位：
Nihon University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1)性決定、性分化に関与する性染色体上の遺伝子のcDNAマクロアレイによる検索:ニワトリの生殖腺分化は6日胚頃から観察される。これに先立つ4日胚の胚全体から雌マイナス雄サブトラクションcDNAライブラリーを作製し、その約5000クローンをマクロアレイ化した(384クローン/アレイX13枚)。この全アレイを4日胚の雌マイナス雄cDNA,雄マイナス雌cDNA,Wpkci cDNA[Hori, T. et al., Mol. Biol. Cell 11:3645-3660(2000)]をそれぞれプローブとして検索し、雌特異的発現の著しい233クローンを選別した。これらのクローンをそれぞれ標識プローブとして、制限酵素消化した雌雄ニワトリゲノムDNAにサザンブロットハイブリダイゼーションを行い、そのパターンからW染色体由来と考えられる59クローンをさらに選別した、これらの全ての塩基配列を決定する予定であるが、現在まで10クローンの配列を決定し、塩基配列およびESTデータベースとの相同性検索を行い、4種の遺伝子、5種のニワトリEST配列、1つのWpkci pre-mRNA配列を同定した。現在、5日胚の生殖隆起+中腎からも同様のサブトラクションcDNAマクロアレイを作製中である。2)ニワトリの雄でZ染色体不活性化現象が存在するか否かの検証:ニワトリZ染色体上の5種の遺伝子(GHR,nAChRβ3,AldB,GT-1,IREBP)とコントロールとして常染色体上の遺伝子GAPDHを選び、それぞれのBACゲノムクローンを用いて、イントロン配列に対するジゴキシゲニン標識アンチセンスリボプローブを作製、それぞれの遺伝子を発現する雌雄の組織の細胞にDNAを変性しない条件下で蛍光in situハイブリダイゼーションを行い、pre-mRNAの局在を検出した。調べた全ての遺伝子で核内に2カ所のシグナルが認められ、これらはそれぞれの遺伝子の局在部位に相当したことから、1本のZ染色体がランダムに不活性化され、その上の大部分の遺伝子の転写が生じなくなるような現象は雄ニワトリでは存在しないと結論した(Kuroda, Y. et al., 2001)。3)ニワトリW染色体に特異的な新規の反復配列SspIファミリーの発見:0.5kb SspI配列単位が約14,000回縦列反復した反復配列がニワトリW染色体短腕の非ヘテロクロマチン末端との境界域に存在することを見いだした(Itoh, Y. et al., in preparation)。この結果、XhoIファミリー、EcoRIファミリーと合わせてW染色体上の反復配列は全体で約39Mbとなり、W染色体の全DNA量は約54Mbと推定されることから、非反復配列は約15Mbと推定される。約480kbの非反復配列クローンのコンテイグから1個のchSpin-W遺伝子が見いだされたこと(Itoh, Y., et al., 2001)を考えると、W染色体の非反復配列域には30個程度の遺伝子が存在すると推定される。

1）通过cDNA宏观阵列搜索与性别确定和性别分化有关的性别染色体的基因搜索：第6个胚胎周围观察到鸡性腺分化。在此之前，从4天胚胎的整个胚胎中制备了女性负男性减法cDNA文库，其中约有5,000个克隆被大量阵列（384个克隆/13个阵列）。将整个阵列搜索雌性阴性雄性cDNA，雄性雌性cDNA和WPKCI cDNA [HORI，T。等，Mol。生物。从4天胚胎中选择了细胞11：3645-3660（2000）]，选择了具有明显女性特异性表达的233个克隆。 Using these clones as a labeled probe, Southern blot hybridization was performed on restriction enzyme-digested male and female chicken genomic DNA, and 59 clones thought to be derived from the pattern, and all of these nucleotide sequences were further selected.However, to date, the sequences of 10 clones have been determined, homology searches were performed with the base sequence and EST database, and four genes, five chicken EST sequences,并确定了一个WPKCI前MRNA序列。目前，从5天胚胎的细菌海拔 + Mesdonia产生了类似的减法cDNA宏观阵列。 2）验证Z染色体灭活是否发生在雄性鸡肉中：鸡Z染色体上的五个基因（GHR，NACHRβ3，ALDB，GT-1，IREBP）和常染色体基因GAPDH作为对照组选择，并选择了用于对照组的BACOROME，并选择了静脉内的核糖序列，并选择了抗氧蛋白的核心序列。在不具有变性DNA的条件下表达每个基因的男性和女性组织的细胞中进行杂交，并检测到前MRNA的定位。由于所检查的所有基因在细胞核中都有两个信号，它们与每个基因的局部位点相对应，因此我们得出的结论是，在雄性鸡中没有现象，其中一个z染色体被随机灭活，大多数基因的转录在上面是不可能的（Kuroda，Y。等，Y。等，2001）。 3）发现了特定于鸡W染色体的重复序列的新型SSPI家族：我们发现，发现重复大约14,000个重复序列为0.5kb SSPI序列单元，存在于鸡W染色体短臂的边界区域，该部门带有非杂色剂末端（Itoh，Y.等）。结果，W染色体上的总重复序列以及XHOI和ECORI家族的总重复序列为39 MB，估计W染色体的总DNA含量约为54 Mb，因此估计非重复序列约为15 MB。考虑到一个chspin-w基因在一个大约480 kb的非重复序列克隆的危险中发现（Itoh，Y。等，2001），据估计，W染色体的非重复序列区域中存在约30个基因。