鳥類のZW型性決定機構のゲノム生物学的アプローチによる解析

使用基因组生物学方法分析鸟类 ZW 型性别决定机制

基本信息

批准号：
14014248
负责人：
水野重樹
金额：
$ 3.52万
依托单位：
Nihon University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.ニワトリW染色体上に制限酵素SspIで切り出される0.5kb単位が11300回縦列反復したSspI-ファミリー反復配列を見いだし、反復単位のクローニングと塩基配列決定を行った。W染色体上のXhoI-,EcoRI-ファミリー反復配列が核内で著しく凝縮したヘテロクロマチンを形成するのに対しSspI-ファミリーは分散したクロマチンを形成した。これは、反復単位中の3'側120bpがGGAGAの反復した、3重鎖形成能をもつポリプリン/ポリピリミジン配列であることによるものと考えた。XhoI-,EcoRI-,SspI-ファミリー反復配列のDNA量を合わせる約38Mbとなり、これに雌減数分裂前期のランプブラッシ染色体上のクロモメアのDAPI染色像からさらにSspI-ファミリー(6Mb)相当の未知の反復配列が存在する可能性を含め、W染色体上の反復配列の総和は約44Mbと推定した。W染色体DNAの全量は約54Mbと考えられていることから、非反復配列は10Mb程度と推定される。先に水野グループが求めたW染色体上のspindlin遺伝子(chSpin-W)周辺の遺伝子密度(1遺伝子/480kb)を適用するとW染色体上の遺伝子数は約20個と推定されるが、これまでに5個が見つかっているのみである。このことから、W染色体上に雌の性決定や初期性分化に関与する未知の重要な遺伝子が存在する可能性を考え、以下のアプローチを行っている。2.生殖腺分化に先立つ2〜5日ニワトリ胚(Hamburger-Hamilton stages 12-27)から雌マイナス雄サブトラクションcDNAライブラリーを作製し、それぞれから約5000クローンずつ、全体で21888クローンを無作為に選びマクロアレイ化した。この中から雌特異的発現レベルが著しく、かつ既知のWpkci遺伝子とは異なる約1000クローンを選別した。現在、この約1000クローンから性染色体由来のものをサザンブロットハイブリダイゼーションにより検索しているが、2日胚(stages 12-13)の段階ですでに雌特異的発現の著しい219クローンが選別されたことは、従来の研究よりさらに早い発生ステージに注目して性決定、初期性分化に関与する遺伝子を検索する必要性を示した。本研究で対象とした初期胚で雌特異的に発現する遺伝子の多くはコピー数を均一化したcDNAプローブで検出されるので、コピー数の少ないmRNAを与えるものと考えられる。これまでに、2日胚で発現するW染色体上の遺伝子として先に水野グループで見いだしたspindlin遺伝子のcDNAクローンが同定された。4日胚からは性染色体上の遺伝子ではないが、BRK1(BMP receptor kinase 1),Rent1(regulator of nonsense transcript 1)のcDNAクローンが同定され、性決定、性分化への関与に興味がもたれる。

1. 我们发现了一个SspI家族重复序列，其中用限制性内切酶SspI切除的0.5kb单元在鸡W染色体上串联重复11,300次，我们克隆了该重复单元并确定了其碱基序列。 W 染色体上的 XhoI 和 EcoRI 家族重复在细胞核中形成高度浓缩的异染色质，而 SspI 家族则形成分散的染色质。这被认为是由于重复单元的3'侧120bp是具有形成三链体能力的聚嘌呤/聚嘧啶序列，其是GGAGA的重复。 XhoI-、EcoRI-和SspI-家族重复序列的总DNA含量约为38 Mb，雌性减数分裂前期灯刷染色体上染色体的DAPI染色图像进一步揭示了与SspI-家族对应的未知重复序列（ W 染色体上重复序列的总数（包括此类序列存在的可能性）估计约为 44 Mb。由于 W 染色体 DNA 总量被认为约为 54 Mb，因此独特序列估计约为 10 Mb。应用Mizuno小组之前确定的W染色体上的spindlin基因（chSpin-W）周围的基因密度（1个基因/480kb），W染色体上的基因数量估计约为20个，但迄今为止只有5个已被发现。基于此，我们考虑W染色体上可能存在一个未知的参与女性性别决定和早期性别分化的重要基因，我们采取了以下方法。 2. 在性腺分化前2至5天，从鸡胚（Hamburger-Hamilton阶段12-27）创建雌性减去雄性的消减cDNA文库，并从中随机选择约5000个克隆，总共21888个克隆，并使用宏阵列。从这些克隆中，我们选择了约 1000 个克隆，它们具有显着的女性特异性表达水平，并且与已知的 Wpkci 基因不同。目前，我们正在通过 Southern blot 杂交从这大约 1000 个克隆中寻找性染色体，并且已经在 2 天胚胎阶段（第 12-13 阶段）选择了具有显着雌性特异性表达的 219 个克隆。寻找参与性别决定和早期性分化的基因，重点关注比以前研究更早的发育阶段。本研究中针对的早期胚胎中雌性特异表达的许多基因是使用具有统一拷贝数的cDNA探针检测到的，因此认为提供了低拷贝数的mRNA。迄今为止，Spindlin 基因的 cDNA 克隆已经被鉴定出来，该基因是 Mizuno 团队之前发现的，作为 W 染色体上的一个基因，在 2 天大的胚胎中表达。在 4 天胚胎中鉴定出了 BRK1（BMP 受体激酶 1）和 Rent1（无义转录物调节因子 1）的 cDNA 克隆，它们不是性染色体上的基因，这引起了人们对它们参与性别决定和性分化的兴趣。