細胞周期におけるヘテロクロマチンDNAの後期複製機構の解析

细胞周期中异染色质DNA晚期复制机制分析

基本信息

批准号：
06262202
负责人：
水野重樹
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ニワトリゲノム中の主要なヘテロクロマチンは性染色体に見られ、W染色体の約65%を占めるXhoI,EcoRI両湾曲反復配列が形成するドメインとZ染色体の一端部に存在する。WヘテロクロマチンのDNAは著しい後期複製が示すが、Z端部ヘテロクロマチンはそのような現象を示さない。本年度の研究概要は以下の通りである。1)Z染色体端部由来のゲノムライブラリーからランダムに選んだ100クローンを混合プローブとして、雌ニワトリのゲノムライブラリーを検索して約13kbのインサートを含むpCHZTH8クローンを得た。蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)により、このクローンがZ染色体端部のヘテロクロマチンを構成する反復DNA配列であることが示された。この配列は明瞭な内部繰返し単位をもたず、湾曲性も示さない。約30kbを単位とするマクロサテライトであり、大部分はGallus属に特有な配列である。2)Wヘテロクロマチンに含まれる非ヒストンタンパク質をXhoI,EcoRIファミリー配列に親和性をもつタンパク質としてサウスウエスタンブロット法やアフィニテイー磁気ビーズ法で検索した。その結果、DNAトポイソメラーゼIとp80が見いだされ、ともに精製し、抗体を作成した。現在、両者のcDNAクローニング、塩基配列決定を進めている。DNAトポイソメラーゼIはin vitroでXhoI,EcoRIファミリー配列中の複数部位に作用することをカンプトテシン存在下の切断活性により示した。p80はクロマチンをわずかにヌクレアーゼ処理すると核から遊離するHMG17に類似した性質を示した。3)アフィニテイー磁気ビーズ法でXhoIファミリーのメチル化状態を認識して結合する2種類のDNA結合タンパク質をMSB-1細胞核から濃縮した。

鸡基因组中的主要异染色质在性染色体上发现，在Z染色体的一端发现，该染色体形成域，Xhoi和Ecori弯曲重复序列，占W染色体的65％。 W杂染色质的DNA以明显的晚期复制为特征，而Z-End异染色质没有表现出这种现象。今年的研究摘要如下。 1）使用从Z染色体末端得出的基因组文库中的100个随机选择的克隆作为混合探针，我们搜索了雌性鸡基因组文库，以获取含有大约13 kb插入物的PCHZTH8克隆。荧光原位杂交（FISH）表明，该克隆是一个重复的DNA序列，构成Z染色体端的异染色质。这种布置没有任何清晰的内部重复单元，也没有表现出曲率。它是一个大约30 kb的单位的宏观阳极岩，大多数是Gallus属所特有的序列。 2）使用西南斑点和亲和力磁珠的蛋白搜索中包含的非历史蛋白作为对Xhoi和Ecori家族序列的亲和力。结果，发现了DNA拓扑异构酶I和p80，并纯化以形成抗体。目前，两者的cDNA克隆和测序正在进行中。在存在Camptothecin的情况下，裂解活性表明，DNA拓扑异构酶I在体外作用于Xhoi和Ecori家族序列的多个位点。 p80表现出与HMG17相似的特性，HMG17在染色质的轻微核酸酶处理后从细胞核中释放出来。 3）通过亲和力磁珠方法，从MSB-1细胞核中富集了两种类型的DNA结合蛋白，这些DNA结合蛋白识别并结合了Xhoi家族的甲基化状态。