細胞周期におけるヘテロクロマチンDNAの後期複製機構の解析

细胞周期中异染色质DNA晚期复制机制分析

基本信息

批准号：
06262202
负责人：
水野重樹
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ニワトリゲノム中の主要なヘテロクロマチンは性染色体に見られ、W染色体の約65%を占めるXhoI,EcoRI両湾曲反復配列が形成するドメインとZ染色体の一端部に存在する。WヘテロクロマチンのDNAは著しい後期複製が示すが、Z端部ヘテロクロマチンはそのような現象を示さない。本年度の研究概要は以下の通りである。1)Z染色体端部由来のゲノムライブラリーからランダムに選んだ100クローンを混合プローブとして、雌ニワトリのゲノムライブラリーを検索して約13kbのインサートを含むpCHZTH8クローンを得た。蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)により、このクローンがZ染色体端部のヘテロクロマチンを構成する反復DNA配列であることが示された。この配列は明瞭な内部繰返し単位をもたず、湾曲性も示さない。約30kbを単位とするマクロサテライトであり、大部分はGallus属に特有な配列である。2)Wヘテロクロマチンに含まれる非ヒストンタンパク質をXhoI,EcoRIファミリー配列に親和性をもつタンパク質としてサウスウエスタンブロット法やアフィニテイー磁気ビーズ法で検索した。その結果、DNAトポイソメラーゼIとp80が見いだされ、ともに精製し、抗体を作成した。現在、両者のcDNAクローニング、塩基配列決定を進めている。DNAトポイソメラーゼIはin vitroでXhoI,EcoRIファミリー配列中の複数部位に作用することをカンプトテシン存在下の切断活性により示した。p80はクロマチンをわずかにヌクレアーゼ処理すると核から遊離するHMG17に類似した性質を示した。3)アフィニテイー磁気ビーズ法でXhoIファミリーのメチル化状態を認識して結合する2種類のDNA結合タンパク質をMSB-1細胞核から濃縮した。

鸡基因组中的主要异染色质存在于性染色体中，存在于由 XhoI 和 EcoRI 弯曲重复形成的结构域（约占 W 染色体的 65%）以及 Z 染色体的一端。 W 端异染色质 DNA 表现出显着的晚期复制，而 Z 端异染色质则不表现出这种现象。今年的研究概要如下。 1)使用从Z染色体末端的基因组文库中随机选择的100个克隆作为混合探针，搜索雌性鸡基因组文库，获得含有约13kb插入片段的pCHZTH8克隆。荧光原位杂交（FISH）显示该克隆是Z染色体末端构成异染色质的重复DNA序列。该序列没有明显的内部重复单元并且不表现出曲率。它是一个单位约为 30 kb 的大卫星，大部分序列是原鸡属独有的。 2)使用Southern印迹和亲和磁珠方法寻找W异染色质中包含的非组蛋白与XhoI和EcoRI家族序列的亲和力。结果，DNA 拓扑异构酶 I 和 p80 被发现，一起纯化，并产生了抗体。我们目前正在进行两者的 cDNA 克隆和核苷酸测序。 DNA 拓扑异构酶 I 在喜树碱存在下具有裂解活性，可在体外作用于 XhoI 和 EcoRI 家族序列的多个位点。 p80 显示出与 HMG17 类似的特性，当染色质用核酸酶轻微处理时，HMG17 就会从细胞核中释放出来。 3)使用亲和磁珠法从MSB-1细胞核中富集了两种识别并结合XhoI家族甲基化状态的DNA结合蛋白。