ツメガエル卵の受精成立の場を精製する試み

尝试改善非洲爪蟾卵的受精部位

• 批准号: 13045026
• 负责人: 佐藤 賢一
• 金额: $ 1.98万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13045026/
• 关键词: 受精; 卵活性化; シグナル伝達; ラフト; チロシンキナーゼ; プロテオミクス; ツメガエル; Src

研究目的 次の目標を掲げ、ツメガエル(以下、ゼノパス)卵の受精成立に関わる場、および関連生体分子を包括的に解析する。1)ゼノパス卵細胞膜ラフトの精製2)卵細胞膜ラフトにおけるシグナル伝達の解析3)受精関連ラフト構成因子の分子クローニング研究成果1)ゼノパス卵より低密度界面活性剤不溶性の膜画分(LD-DIM)を調製した。LD-DIMは全卵蛋白質の0.1%しか含まない一方で、コレステロールやGM1ガングリオシドに富む、いわゆる「ラフト」的性質を持っていた。LD-DIMは受精成立の鍵分子の一つであるチロシンキナーゼXykを含み、受精時の蛋白質チロシンリン酸化の場であることなどがわかった。LD-DIMからコレステロールを除去する薬剤処理を行うと受精阻害がおこった。このことは、LD-DIMが受精の成立に必要とされる細胞膜マイクロドメインであることを示唆している。2)1の結果を受けて、精製されたLD-DIMを使った受精シグナル伝達の再構成実験を開始した。LD-DIMがチロシンキナーゼ活性を保持していること、また驚いたことに生きた精子によってその活性が上昇することがわかった。このようなLD-DIMの「活性化」は幾つかの薬剤(GTPgsや過酸化水素)によっても再現可能であった。3)神戸大学バイオシグナル研究センターの吉野博士との共同により精製Xykの質量分析実験を行った。その結果、XykはゼノパスSrc遺伝子産物(Src1、Src2)の混合物であることが明らかになった。そこで、Src1/Src2遺伝子のクローニングと遺伝子改変を行い、野生型・活性化型・及び不活性化型の3種の遺伝子構築を完了した。COS7細胞を用いた発現実験から、Xykのラフト局在や、Xyk依存的な蛋白質チロシンリン酸化活性が確認された。

研究目标：我们将全面分析Xenopus受精（以下称为Xenopus）卵的鸡蛋以及相关的生物分子的施肥的地点。 1）异武鸡蛋质膜筏的纯化2）卵质膜筏中信号传导的分析3）分子克隆研究结果与受精相关的筏组成部分1）从盐尼匹克蛋白中制备低密度表面活性剂 - 突击剂 - 突击剂 - 突击剂膜效果（LD-DIM）。虽然LD-DIM仅包含全卵蛋白的0.1％，但它也具有所谓的“筏”样特性，富含胆固醇和GM1神经节剂。已经发现LD-DIM含有酪氨酸激酶XYK，这是受精的关键分子之一，是受精过程中蛋白质酪氨酸磷酸化的部位。当进行化学疗法以从LD-DIM中去除胆固醇时，就会发生受精抑制作用。这表明LD-DIM是建立​​施肥所需的细胞膜微域。 2）在1中的结果之后，我们开始使用纯化的LD-DIM进行重建实验，以进行受精信号传导。人们发现LD-DIM保留了酪氨酸激酶活性，令人惊讶的是，活精子会增加其活性。 LD-DIMS的这种“激活”也可以由几种药物（GTPG和过氧化氢）再现。 3）纯化XYK的质谱实验是与科比大学生物信号研究中心的Yoshino合作进行的。结果表明，XYK是异种症SRC基因产物（SRC1，SRC2）的混合物。因此，将SRC1/SRC2基因克隆并进行了基因修饰，并完成了三种野生型，激活和灭活型的基因的构建。使用COS7细胞的表达实验证实了XYK和XYK依赖性蛋白酪氨酸磷酸化活性的筏定位。

项目成果

Sato, Ken-ichi: "Hydrogen peroxide induces Src family tyrosine kinase-dependent activation of Xenopus eggs"Devlopment Growth and Differentiation. 43. 55-72 (2001)

Sato, Ken-ichi：“过氧化氢诱导爪蟾卵的 Src 家族酪氨酸激酶依赖性激活”发育、生长和分化。

Fukami, Yasuo: "Inhibition and activation of c-Src : The head and tail of a coin"Pharmacology and Therapeutics. (印刷中). (2002)

Fukami Yasuo：“c-Src 的抑制和激活：硬币的头部和尾部”药理学和治疗（印刷中）。

Sato, Ken-ichi: "Low density detergent-insoluble membrane of Xenopus eggs : Subcellular microdomain for tyrosine kinase signaling in feftilization"Development. 129(印刷中). (2002)

Sato，Ken-ichi：“非洲爪蟾卵的低密度去污剂不溶性膜：受精过程中酪氨酸激酶信号传导的亚细胞微结构域”129（出版中）。

Tokmakov, Alexander A.: "Calcium oscillations in Xenopus egg cycling extracts"Journal of Cellular Biochemistry. 82. 89-97 (2001)

Tokmakov，Alexander A.：“非洲爪蟾卵循环提取物中的钙振荡”细胞生物化学杂志。