両生類卵の受精におけるチロシンキナーゼ―カルシウムシグナリング経路の解析

两栖类卵受精过程中酪氨酸激酶-钙信号通路分析

• 批准号: 12780556
• 负责人: 佐藤 賢一
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12780556/
• 关键词: 受精; 卵活性化; 蛋白質チロシンリン酸化; シグナル伝達; Xenopus; Src; 過酸化水素; 細胞膜マイクロドメイン; Shc; ホスホリパーゼCγ

1)ツメガエル(以下、ゼノパス)卵チロシンキナーゼXykの分子生物学的解析:神戸大学バイオシグナル研究センターの吉野博士との共同により、精製したXykの質量分析実験を行った。その結果、XykはゼノパスSrc遺伝子産物(Src1、Src2)の混合物であることが明らかになった。そこで、Src1/Src2遺伝子のクローニングを行い、野生型、活性化型、及び不活性化型遺伝子の構築を完了した。さらにXykのアミノ酸配列をもとに合成したペプチドを抗原に、抗体を2種類作成した。抗体はウエスタン法、免疫沈降法の両方でXykに高い特異性と結合性を示した。今後はXykの卵細胞での過剰発現実験を基にして、受精成立におけるXykの必要十分性について検証する。2)受精依存的チロシンリン酸化の可視化:抗リン酸化チロシン抗体を使った免疫組織化学的手法により、動物極側表層の一部が受精卵におけるチロシンリン酸化の場であることを見い出した。このリン酸化反応の極性は、精子と卵の結合が動物極に限られることと一致している。このような極性をもったチロシンリン酸化は、過酸化水素処理を受けた卵でより顕著に見られた。この知見から、過酸化水素処理が卵におけるチロシンリン酸化の解析モデル系として有用であることが示された。3)受精成立に関与する細胞膜マイクロドメインの生化学的解析:ゼノパス卵より低密度界面活性剤不溶性の膜画分(LD-DIM)を調製した。LD-DIMはコレステロールやGM1ガングリオシドに富むいわゆる「ラフト」的性質を持ち、Xykを含み、受精時のチロシンリン酸化の場であることがわかった。LD-DIMからコレステロールを除去する薬剤処理を行うと受精阻害がおこった。このことは、LD-DIMの機能が受精成立に必要であることを示唆している。今後はLD-DIMの網羅的な蛋白質同定と受精シグナル伝達の再構成実験を行う。

1）爪蟾卵酪氨酸激酶Xyk的分子生物学分析：我们与神户大学生物信号研究中心的Yoshino博士合作，对纯化的Xyk进行了质谱实验。结果表明，Xyk 是非洲爪蟾 Src 基因产物（Src1、Src2）的混合物。因此，我们克隆了Src1/Src2基因，完成了野生型、激活型和失活型基因的构建。此外，使用基于Xyk的氨基酸序列合成的肽作为抗原，制备了两种类型的抗体。通过 Western 和免疫沉淀方法，该抗体显示出高特异性并与 Xyk 结合。今后我们将通过卵细胞中Xyk的过表达实验来验证Xyk对于受精建立的必要性和充分性。 2）受精依赖性酪氨酸磷酸化的可视化：通过使用抗磷酸酪氨酸抗体的免疫组织化学方法，我们发现动物极表层的一部分是受精卵中酪氨酸磷酸化的位点。这种磷酸化反应的极性与精卵结合到动物极的限制一致。这种极性酪氨酸磷酸化在用过氧化氢处理的鸡蛋中更为明显。这一发现表明过氧化氢处理可作为分析鸡蛋中酪氨酸磷酸化的模型系统。 3）参与受精的细胞膜微区的生化分析：从爪蟾卵中制备低密度去污剂不溶性膜组分（LD-DIM）。研究发现LD-DIM具有所谓的“筏”状特性，富含胆固醇和GM1神经节苷脂，含有Xyk，并且是受精过程中酪氨酸磷酸化的位点。当 LD-DIM 用药物去除胆固醇时，会发生受精抑制。这表明LD-DIM的功能对于受精的建立是必要的。未来我们将开展LD-DIM的全面蛋白鉴定和受精信号转导的重建实验。

项目成果

Fukami, Yasuo: "Inhibition and activation of c-Src : The head and tail of a coin"Pharmacology and Therapeutics. (印刷中). (2002)

Fukami Yasuo：“c-Src 的抑制和激活：硬币的头部和尾部”药理学和治疗（印刷中）。

Sato,K.-I.: "Regulation of Xenopus oocyte maturation, egg fertilization and embryogenesis by protein-tyrosine phosphorylation."Curr.Top.Biochem.Res.. 2. 91-102 (2000)

Sato,K.-I.：“通过蛋白质酪氨酸磷酸化调节非洲爪蟾卵母细胞成熟、卵子受精和胚胎发生。”Curr.Top.Biochem.Res.. 2. 91-102 (2000)

Tokmakov,A.A.: "Calcium oscillations in Xenopus egg cycling extracts."J.Cell.Biochem.. (印刷中).

Tokmakov, A.A.：“非洲爪蟾卵循环提取物中的钙振荡。”J.Cell.Biochem..（正在出版）。

Sato,K.-I.: "Fertilization signalling and protein-tyrosine kinases."Comp.Biochem.Physiol.B Biochem.Mol.Biol.. 126. 129-148 (2000)

Sato,K.-I.：“受精信号传导和蛋白酪氨酸激酶。”Comp.Biochem.Physiol.B Biochem.Mol.Biol.. 126. 129-148 (2000)

Sato, Ken-ichi: "Hydrogen peroxide induces Src family tyrosine kinase-dependent activation of Xenopus eggs"Development Growth and Differentiation. 43. 55-72 (2001)

Sato, Ken-ichi：“过氧化氢诱导爪蟾卵的 Src 家族酪氨酸激酶依赖性激活”发育、生长和分化。