脳脊髄液中α-synuclein微量測定による神経変性疾患診断方法開発の試み

尝试开发一种通过测量脑脊液中少量α-突触核蛋白来诊断神经退行性疾病的方法

• 批准号: 12877096
• 负责人: 岩坪 威
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12877096/
• 关键词: パーキンソン病; Lewy小体型痴呆症; α-Synuclein; 生化学マーカー; 髄液診断

α-シヌクレインはパーキンソン病、Lewy小体型痴呆症(DLB)、多系統萎縮症(MSA)などで不溶性線維を形成して脳に蓄積するシナプス蛋白である。遺伝学的、病理学的知見から、α-シヌクレインの凝集は神経細胞死に深い関連を有する変化と考えられている。昨年度までに我々はDLBなどのシヌクレイン蓄積症の脳で不溶化したα-シヌクレインは、C末端側に位置するセリン129が高度にリン酸化されていることを蛋白化学的に同定した。アルツハイマー病(AD)脳神経細胞に蓄積するタウ蛋白がやはり高度のリン酸化を受けており、脳脊髄液中のリン酸化タウがADのよい生化学的診断マーカーとなることを考え合わせると、脳脊髄液中のα-シヌクレイン、特にリン酸化α-シヌクレインを定量することはシヌクレイノパチーの診断に有用である可能性がある。我々はα-シヌクレインのセリン129位のリン酸化を特異的に認識するモノクローナル抗体#64を樹立し、これを用いた酵素免疫測定法(ELISA)の作出を試みた。サンドウィッチELISA法の捕捉抗体として、α-シヌクレインのC末端側を認識するモノクローナル抗体#102を使用し、直接HRP標識したリン酸化依存性抗体#64を検出抗体とする系を組み立てた。このELISAは、カゼインキナーゼ2でセリン129をリン酸化したリコンビナントα-シヌクレインをカットオフ値4ng/mlで検出し、非リン酸化α-シヌクレインとは反応しなかった。DLB脳抽出物尿素可溶画分に回収されるリン酸化α-シヌクレインの定量的検出にも本ELISA系は有効であった。脳脊髄液に適用するために、α-シヌクレインのアミノ末端側と結合する高親和性の捕捉抗体を用いることなどにより感度をさらに改善すべく、系を改良中である。

α-突触核蛋白是一种突触蛋白，可形成不溶性纤维并在帕金森病、路易体痴呆（DLB）、多系统萎缩症（MSA）等患者的大脑中积聚。基于遗传学和病理学发现，α-突触核蛋白聚集被认为是与神经元细胞死亡密切相关的变化。去年，我们通过蛋白质化学发现，在DLB等突触核蛋白储存疾病的大脑中不溶解的α-突触核蛋白，位于C端侧的丝氨酸129处高度磷酸化。考虑到阿尔茨海默病 (AD) 脑神经元中积累的 tau 蛋白高度磷酸化，并且脑脊液中的磷酸化 tau 是 AD 良好的生化诊断标志物，定量脑脊液中的 α-突触核蛋白，尤其是磷酸化 α-突触核蛋白可能可用于诊断突触核蛋白病。我们建立了特异性识别 α-突触核蛋白丝氨酸 129 处磷酸化的单克隆抗体 #64，并尝试使用该抗体创建酶联免疫吸附测定 (ELISA)。构建了一个系统，其中识别α-突触核蛋白C末端侧的单克隆抗体#102用作夹心ELISA的捕获抗体，并使用直接用HRP标记的磷酸化依赖性抗体#64作为检测抗体。该 ELISA 检测到重组 α-突触核蛋白在丝氨酸 129 处被酪蛋白激酶 2 磷酸化，截止值为 4 ng/ml，并且不与非磷酸化 α-突触核蛋白发生反应。该 ELISA 系统对于定量检测 DLB 脑提取物的尿素可溶部分中回收的磷酸化 α-突触核蛋白也有效。对于脑脊液中的应用，该系统正在进行改进，以进一步提高灵敏度，包括使用与 α-突触核蛋白氨基末端结合的高亲和力捕获抗体。

项目成果

Piao Y-S: "Co-localization of α-synuclein and phosphorylated tau in neuronal and glial cytoplasmic inclusions on a patient with multiple system atrophy of long duration"Acta Neuropathol. 101. 285-293 (2001)

Piao Y-S：“长期多系统萎缩患者的神经元和胶质细胞质内含物中 α-突触核蛋白和磷酸化 tau 蛋白的共定位”《神经病理学报》101. 285-293 (2001)。

Kahle PJ: "Selective insolubility of α-synuclein in human Lewy body diseases is recapitulated in a transgenic mouse model"Am J Pathol. 159. 2215-2225 (2001)

Kahle PJ：“在转基因小鼠模型中重现了 α-突触核蛋白在人类路易体疾病中的选择性不溶性”Am J Pathol。159. 2215-2225 (2001)

Wakabayashi K,Fukushima T,Koide R,Horikawa Y,Hasegawa M,Watanabe Y,Noda T,Eguchi I,Morita T,Yoshimoto M,Iwatsubo T,Takahashi H: "Juvenile-onset generalized neuroaxonal dystrophy (Hallervorden-Spatz disese) with diffuse neurofibrillary and Lewy body pathol

Wakabayashi K、Fukushima T、Koide R、Horikawa Y、Hasekawa M、Watanabe Y、Noda T、Eguchi I、Morita T、Yoshimoto M、Iwatsubo T、Takahashi H：“青少年发病的广泛性神经轴索营养不良症（Hallervorden-Spatz 病）

Fujiwara H: "α-synuclein is phosphorylated in synucleinopathy lesions"Nature Cell Biology. 4. 160-164 (2002)

Fujiwara H：“α-突触核蛋白在突触核蛋白病病变中被磷酸化”《自然细胞生物学》4. 160-164 (2002)。

Okochi M,Walter J,Koyama A,Nakajo S,Baba M,Iwatsubo T,Meijer L,Kahle P,Haass C: "Constitutive phosphorylation of the Parkinson's disease associated α-synuclein"J Biol Chem. 275. 390-397 (2000)

Okochi M、Walter J、Koyama A、Nakajo S、Baba M、Iwatsubo T、Meijer L、Kahle P、Haass C：“帕金森病相关 α-突触核蛋白的组成型磷酸化”J Biol Chem. 275. 390-397 (2000) ）