α-Synucleinopathyの病態解析に基づく神経細胞死の制御

基于α-突触核蛋白病的病理分析控制神经细胞死亡

• 批准号: 12031204
• 负责人: 岩坪 威
• 金额: $ 0.9万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12031204/
• 关键词: パーキンソン病; Lewy小体型痴呆症; Lewy小体; α-Synuclein

パーキンソン病(PD)、Lewy小体型痴呆症(DLB)の脳にはLewy小体(LB)などの形でα-synucleinが凝集・蓄積すること、家族性PD家系でα-synucleinの変異が見出されたことからα-synucleinのPD発症における役割が注目されている。本年度はDLB脳に蓄積したα-synucleinを精製し、特徴的な翻訳後修飾を蛋白化学的に解析した。DLB脳及び正常脳を段階的に可溶化すると、正常な可溶性α-synucleinは主にTris緩衝液に回収された。不溶画分を8M尿素に溶解すると、DLB脳特異的に約15kDの不溶性α-synucleinが検出された。尿素に溶解した蓄積α-synucleinをQ-sepharoseカラム・HPLCで精製、臭化シアンで消化後、HPLCでペプチド断片を分離し、MALDI-TOF Massで解析すると、128-140ペプチドに対応する質量数1515のシグナルに加えて、質量数1595を示すシグナルが検出された。さらに質量数1595のピークをMS/MS解析に供し、Ser129のリン酸化を確認した。リン酸化ペプチドを抗原としてSer129リン酸化α-synuclein特異抗体を作製しPD,DLB脳を染色すると、LB及びLewy neuriteが陽性を示した。DLB脳由来α-synucleinのウェスタンブロットでも、リン酸化α-synuclein特異抗体は約15kDaの不溶化α-synucleinのみと反応し、正常α-synucleinは反応しなかった。α-synucleinのSer129はG蛋白結合型受容体キナーゼ(GRK),CK1,CK2などによりリン酸化されうるが、そのレベルは生理的条件下では低いことが示されている。PD,DLB脳におけるα-synuclein蓄積の原因にリン酸化が関与する可能性がある。

α-突触核蛋白以路易体（LB）的形式在帕金森病（PD）和路易体痴呆（DLB）的大脑中聚集和积累，并且在家族性PD家族中观察到了α-突触核蛋白突变的作用。 α-突触核蛋白在PD发病过程中的作用一直备受关注。今年，我们纯化了 DLB 大脑中积累的 α-突触核蛋白，并对其特征性翻译后修饰蛋白进行了化学分析。当DLB脑和正常脑逐步溶解时，正常可溶性α-突触核蛋白主要在Tris缓冲液中回收。当将不溶部分溶解在8M尿素中时，在DLB脑中特异地检测到约15kD的不溶性α-突触核蛋白。使用Q-琼脂糖柱和HPLC纯化溶解在尿素中的积累的α-突触核蛋白，用溴化氰消化后，使用HPLC分离肽片段并使用MALDI-TOF Mass进行分析，得到对应于128-140个肽的质量数除了1515的信号之外，还检测到质量数为1595的信号。另外，对质量数1595的峰进行MS/MS分析，确认了Ser129的磷酸化。当使用磷酸化肽作为抗原，用 Ser129 磷酸化 α-突触核蛋白特异性抗体对 PD 和 DLB 脑进行染色时，LB 和路易神经突呈阳性。在DLB脑源性α-突触核蛋白的Western blotting中，磷酸化的α-突触核蛋白特异性抗体仅与约15 kDa的不溶性α-突触核蛋白发生反应，不与正常的α-突触核蛋白发生反应。 α-突触核蛋白的 Ser129 可被 G 蛋白偶联受体激酶 (GRK)、CK1、CK2 等磷酸化，但在生理条件下其水平较低。磷酸化可能参与 PD 和 DLB 大脑中 α-突触核蛋白的积累。

项目成果

Wakabayashi K,Fukushima T,Koide R,Horikawa Y,Hasegawa M,Watanabe Y,Noda T,Eguchi I,Morita T,Yoshimoto M,Iwatsubo T,Takahashi H: "Juvenile-onset generalized neuroaxonal dystrophy (Hallervorden-Spatz disese) with diffuse neurofibrillary and Lewy body pathol

Wakabayashi K、Fukushima T、Koide R、Horikawa Y、Hasekawa M、Watanabe Y、Noda T、Eguchi I、Morita T、Yoshimoto M、Iwatsubo T、Takahashi H：“青少年发病的广泛性神经轴索营养不良症（Hallervorden-Spatz 病）

Okochi M,Walter J,Koyama A,Nakajo S,Baba M,Iwatsubo T,Meijer L,Kahle P,Haass C: "Constitutive phosphorylation of the Parkinson's disease associated α-synuclein"J Biol Chem. 275. 390-397 (2000)

Okochi M、Walter J、Koyama A、Nakajo S、Baba M、Iwatsubo T、Meijer L、Kahle P、Haass C：“帕金森病相关 α-突触核蛋白的组成型磷酸化”J Biol Chem. 275. 390-397 (2000) ）

Yamazaki M,Arai Y,Baba M,Iwatsubo T,Mori O,Katayama Y,Oyanagi K: "α-synuclein inclusions in amygdala in the brains of patients with Parkinsonism-Dementia Complex of Guam"J Neuropathol Exp Neurol. 59. 585-591 (2000)

Yamazaki M、Arai Y、Baba M、Iwatsubo T、Mori O、Katayama Y、Oyanagi K：“关岛帕金森病-痴呆症患者大脑中杏仁核中的 α-突触核蛋白内含物”J Neuropathol Exp Neurol 59。 585- 591 (2000)