Lewy小体構成分子の解析

路易体构成分子的分析

• 批准号: 07264211
• 负责人: 岩坪 威
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07264211/
• 关键词: Lewy小体; パーキンソン病; ユビキチン; 神経病理学; 汎発生Lewy小体病

Lewy小体(LB)の構成成分を生化学的に同定することを目標に、汎発性Lewy小体病(DLBD)大脳皮質から単離精製したLBを抗原としてモノクローナル抗体を作製した。昨年度までに報告した方法に従って、不連続ショ糖密度勾配遠心法で得られた粗LB画分を抗ユビキチン抗体(MAB1510)もしくは抗ニューロフィラメント抗体RM032でFITC蛍光ラベルし、セルソーター(Epics Elite,Coulter)で2回処理後、1%サルコシルで洗浄し、精製LB画分を得た。LB約200万個から70%蟻酸で抽出した約30μg相当の蛋白を1%SDS存在下でマウス足底部に免役後、膝窩リンパ節からハイブリドーマを作製し、粗LB画分スメア上のLBを陽性に染色するクローンを選択した。このうちの1クローン(LB112)はスメア及びエタノール固定凍結標本上でほぼ全てのLBを強陽性に染色したが、神経原線維変化(NFT)は弱く染まるのみであった。LB112は遊離型の単量体ユビキチンとはドットブロット、イムノブロット上で反応しなかったが、ポリユビキチン化リゾチームおよび純粋なポリユビキチン鎖と強く反応し、モノユビキチン化されたヒストンH2Aとは反応しなかった。これらの所見はLB112がポリユビキチン鎖特異抗体であることを強く示唆し、LBはポリユビキチン鎖を含むことが明らかになった。ポリユビキチン鎖は、分解シグナルとしてプロテアソームによって認識され、ポリユビキチン鎖を含む蛋白質は分解される。PHFのタウ蛋白に結合したユビキチンの70-80%が、プロテアソームによって認識されないモノユビキチンの形をとることが示されており、Lewy小体とPHFにおけるユビキチンの存在様式は異なることが示唆される。

为了通过生化鉴定路易体 (LB) 的成分，我们使用从弥漫性路易体病 (DLBD) 的大脑皮层中分离纯化的 LB 作为抗原，制备了单克隆抗体。根据去年报道的方法，使用抗泛素抗体（MAB1510）或抗神经丝抗体RM032和细胞分选仪（Epics Elite，用1% Sarcosyl处理两次后，得到纯化的LB级分。将约200万个LB中用70％甲酸提取的约30μg蛋白在1％SDS存在下免疫于小鼠足底部分，从腘淋巴结制备杂交瘤，并将LB放在粗LB级分涂片上选择染色阳性的克隆。在涂片和乙醇固定的冷冻标本上几乎所有 LB 中，一个克隆 (LB112) 均呈强阳性染色，但神经原纤维缠结 (NFT) 仅呈弱染色。 LB112在斑点印迹或免疫印迹上不与游离单体泛素反应，但与多泛素化溶菌酶和纯多泛素链强烈反应，并且不与单泛素化组蛋白H2A反应。这些发现强烈表明LB112是多聚泛素链特异性抗体，并且揭示LB含有多聚泛素链。多聚泛素链被蛋白酶体识别为降解信号，含有多聚泛素链的蛋白质被降解。研究表明，PHF中与tau蛋白结合的泛素有70-80%以单泛素形式存在，不被蛋白酶体识别，提示路易体和PHF中泛素的存在方式不同。

项目成果

Mann DMA: "Amyloid(Aβ)deposition in chromorome 1.4-linleed Alzheimer's diseoro predominance of Aβ42(43)" Annals of Neurology. (in press). (1996)

Mann DMA：“染色体 1.4-linleed 阿尔茨海默氏病 Aβ42(43) 中的淀粉样蛋白 (Aβ) 沉积”《神经病学年鉴》（1996 年出版）。

Iwatsubo T: "Purification and characterization of Lewy bodies from the breins of patients with diffuse Lewy body disease." American Journal of Pathology. 148(in press). (1996)

Iwatsubo T：“从弥漫性路易体病患者的大脑中纯化和表征路易体。”

Iwatsubo T: "Amyloid β protein(Aβ)deposition:Aβ(42,43)precedes Aβ 40 in Down's syndres" Annals of Neurology. 37. 294-299 (1995)

Iwatsubo T：“β 淀粉样蛋白 (Aβ) 沉积：唐氏综合症中 Aβ(42,43) 先于 Aβ 40”《神经学年鉴》37. 294-299 (1995)。

Mann DMA: "Predominant deposition of Aβ42(43)in plaques in cases of Alzhimer's disease and hereditary cerebral haemonhage associated unthmutations in the APP gese" American Journal of Pathology. 148. in press (1996)

Mann DMA：“阿尔茨默病和遗传性脑出血相关的 APP gese 斑块中 Aβ42(43) 的主要沉积”，美国病理学杂志 148，出版 (1996)。

Fukumoto H: "Amyloid β protein(Aβ)deposition in normal aging has the same characteristics as that in Alzheimen's disease." American Journal of Pathology. 148. 259-266 (1996)

Fukumoto H：“正常衰老过程中的淀粉样蛋白 (Aβ) 沉积与阿尔茨海默病中的沉积具有相同的特征。”148. 259-266 (1996)。