Th1反応における情報伝達制御機構の解明-IL-12Rを介したIFN-γ産生へのシグナル伝達-

阐明Th1反应中的信息转导控制机制 - 通过IL-12R信号转导至IFN-γ的产生 -

基本信息

批准号：
12051210
负责人：
善本隆之
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Tokyo Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12051210/
关键词：
IL-12 Rceptor CD28 CTLA-4 IFN-γ Two-Hybrid Screening Retroviral Expression Cloning B7-1 2

项目摘要

ヒトIL-12Rβ1およびβ2細胞内領域をBaitとしLexAのTwo-Hybrid法でスクリーニングを試みたがポジティブクローンが得られなかった。そこで、マウスIL-12Rβ1およびβ2細胞内領域をBaitとしGAL4のTwo-Hybrid法を用いマウスT細胞リンパ腫瘍株(V13)由来cDNAライブラリーをスクリーニングしたところ、未知の分子を含む複数個のポジティブクローンが得られた。現在、得られて遺伝子を培養細胞株へトランスフェクトし、IL-12Rβ1およびβ2への会合やIL-12Rを介したシグナル伝達における役割を検討中である。レトロウイルスベクターを用いた発現クローニングでは、IFN-γのGenomic遺伝子のATGの後にピューロマイシン抵抗性遺伝子を挿入したプラスミドを構築しトランスフェクタントを作製したが、薬剤耐性による選択でIFN-γ発現誘導が識別できなかった。そこで、GFP遺伝子を挿入したプラスミドを構築しT細胞株のトランスフェクタントを作製し、IFN-γ発現誘導をGFPの蛍光強度の増大で見られる系を確立した。現在、レトロウイルスライブラリー感染後、蛍光強度が増大する細胞をFACSにより分集し導入された遺伝子を解析中である。B7-1/2のT細胞側のCounterpartであるCD28/CTLA-4のIL-12R発現増強への関与を解析した結果、機能的IL-12Rの発現にはCD28からの刺激はポジティブにCTLA-4からの刺激はネガティブに働くこと、さらにIFN-γKOマウスを用いても同様な効果が見られることを示し、IL-12R発現におけるB7-1/2-CD28/CTLA-4刺激の重要性を明らかにした。さらに、CTLA-4からの刺激はナイーブT細胞のTh1への分化を増強すること、この際IL-12の関与は少なくTGF-βを部分的に介しいることも明らかにした。

使用人IL-12Rβ1和β2细胞内区域作为诱饵，尝试使用LexA二杂交方法进行筛选，但没有获得阳性克隆。因此，当我们以小鼠IL-12Rβ1和β2细胞内区域为诱饵，使用GAL4双杂交方法筛选源自小鼠T细胞淋巴肿瘤系（V13）的cDNA文库时，我们发现获得了多个含有未知分子的阳性克隆。。我们目前正在将获得的基因转染到培养细胞系中，并研究其与IL-12Rβ1和β2的关联及其在IL-12R介导的信号转导中的作用。在使用逆转录病毒载体的表达克隆中，构建了在IFN-γ基因组基因的ATG后插入嘌呤霉素抗性基因的质粒以产生转染子，但IFN-γ的表达受到药物抗性选择的抑制。确定。因此，我们构建了插入了 GFP 基因的质粒，创建了 T 细胞系转染子，并建立了一个系统，其中可以通过 GFP 荧光强度的增加看到 IFN-γ 表达的诱导。目前，我们正在使用FACS收集感染逆转录病毒文库后荧光强度增加的细胞，并对导入的基因进行分析。通过分析 CD28/CTLA-4（B7-1/2 T 细胞侧的对应物）在增强 IL-12R 表达中的参与情况，我们发现 CD28 的刺激对功能性 IL 的表达产生积极影响-12R。我们发现 B7-1/2-CD28/CTLA-4 的刺激对 IL-12R 表达有负面影响，并且使用 IFN-γKO 小鼠观察到类似的效果，这证明了 B7-1/2-CD28 的重要性/CTLA-4 刺激 IL-12R 表达。此外，我们发现 CTLA-4 的刺激增强了幼稚 T 细胞的 Th1 分化，并且这部分是由 TGF-β 介导的，而 IL-12 的参与很少。