IL-12の発現調節機構に関する基礎的研究

IL-12表达调控机制的基础研究

基本信息

批准号：
08770228
负责人：
善本隆之
金额：
$ 0.64万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08770228/
关键词：
IL-12 発現調節 CD40 NF-κB

项目摘要

IL-12 p40 mRNA発現はCD40L-CD40を介した刺激により誘導されるが、今年度はこのp40発現誘導の分子レベルでの解析を行った。まず、細胞表面上にCD40を強く発現しているヒトのB細胞腫Daudi細胞を、Agonisticな抗CD40抗体で刺激すると、RT-PCRによりmRNAレベルでのp40発現増大と、培養上清中のELISAにより蛋白レベルでの産生が見られた。さらに、この産生はCD32(FcγRII)をトランスフェクトしたL細胞を共存させてAgonisticな抗CD40抗体で刺激すると増大され、またCD40Lの発現ベクターを一過性にトランスフェクトしてもより高いp40産生が見られた。そこでこのDaudi細胞を用い解析を行った。まず、転写開始視点から上流約120bp及び200bpに存在するNF-kB部位(各々#1と#2)を含む約30merのオリゴヌクレオチドを作製し、Agonisticな抗CD40抗体で刺激したDaudi細胞の核抽出物を用いてゲルシフトアッセイを行うと、NF-κB(#1)を含むオリゴヌクレオチドとは結合物の生成が見られたが、NF-κB(#2)とは見られなかった。さらに、このNF-κB(#1)との結合は過剰な非標識オリゴヌクレオチド及びMHC ClassIに存在するAuthenticなNF-κB部位を含むオリゴヌクレオチドにより阻害され、またこのNF-κB(#1)部位に変異を入れたオリゴヌクレオチドでは阻害されないことや、NF-κBに対する種々の抗体を用いた阻害実験によりこの結合生成が特異的であることが明らかとなった。またKinetics解析の結果、この結合は刺激後15分からでも見られた。以上の結果より、p40のプロモーター領域の転写開始点から上流約120bpに存在するNF-κB(#1)がCD40L-CD40を介した刺激によるp40発現誘導に重要であることが示唆された。現在さらに、CATアッセイを用いプロモーター活性での解析を検討中である。

IL-12 p40 mRNA表达是通过CD40L-CD40介导的刺激诱导的，但是今年我们分析了P40表达诱导的这一分子水平。首先，当用激动剂抗CD40抗体刺激在细胞表面上强烈表达CD40的人B-胞瘤DAUDI细胞时，RT-PCR在mRNA水平上升高了p40表达，而ELISA在培养物中的ELISA在蛋白质水平上产生了p40。此外，当用CD32（FcγRII）转染L细胞并存并与激动剂抗CD40抗体刺激时，该产生增加了，即使转染CD40L表达载体，也观察到较高的P40产生。因此，使用这些Daudi细胞进行分析。首先，从转录开始的角度来看，准备大约30个含有NF-KB位点的MER寡核苷酸（分别为＃1和＃2），以大约120 bp和200 bp的上游制备，并使用用抗激抗CD40抗体刺激的Daudi细胞核提取物进行凝胶移位测定。观察到与含有NF-κB的寡核苷酸（＃1）的共轭物质的形成，但未观察到NF-κB（＃2）。此外，过量的未标记的寡核苷酸和含有MHC ClassI中真实NF-κB位点的寡核苷酸和寡核苷酸抑制了与NF-κB（＃1）的结合，并未通过该NF-κB（＃1） - ＃1-κB（＃1）的寡核苷酸抑制，并且不受寡核苷酸的抑制，并在＃1）中抑制。揭示了这种结合产生是特定的。此外，动力学分析表明，刺激后15分钟也可以看到这种结合。以上结果表明，NF-κB（＃1）位于p40启动子区域的转录起点上游约120 bp，对于通过CD40L-CD40介导的刺激诱导P40表达很重要。此外，正在使用CAT分析研究启动子活性的分析。