IL-12の発現調節機構に関する基礎的研究

IL-12表达调控机制的基础研究

基本信息

批准号：
08770228
负责人：
善本隆之
金额：
$ 0.64万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08770228/
关键词：
IL-12 発現調節 CD40 NF-κB

项目摘要

IL-12 p40 mRNA発現はCD40L-CD40を介した刺激により誘導されるが、今年度はこのp40発現誘導の分子レベルでの解析を行った。まず、細胞表面上にCD40を強く発現しているヒトのB細胞腫Daudi細胞を、Agonisticな抗CD40抗体で刺激すると、RT-PCRによりmRNAレベルでのp40発現増大と、培養上清中のELISAにより蛋白レベルでの産生が見られた。さらに、この産生はCD32(FcγRII)をトランスフェクトしたL細胞を共存させてAgonisticな抗CD40抗体で刺激すると増大され、またCD40Lの発現ベクターを一過性にトランスフェクトしてもより高いp40産生が見られた。そこでこのDaudi細胞を用い解析を行った。まず、転写開始視点から上流約120bp及び200bpに存在するNF-kB部位(各々#1と#2)を含む約30merのオリゴヌクレオチドを作製し、Agonisticな抗CD40抗体で刺激したDaudi細胞の核抽出物を用いてゲルシフトアッセイを行うと、NF-κB(#1)を含むオリゴヌクレオチドとは結合物の生成が見られたが、NF-κB(#2)とは見られなかった。さらに、このNF-κB(#1)との結合は過剰な非標識オリゴヌクレオチド及びMHC ClassIに存在するAuthenticなNF-κB部位を含むオリゴヌクレオチドにより阻害され、またこのNF-κB(#1)部位に変異を入れたオリゴヌクレオチドでは阻害されないことや、NF-κBに対する種々の抗体を用いた阻害実験によりこの結合生成が特異的であることが明らかとなった。またKinetics解析の結果、この結合は刺激後15分からでも見られた。以上の結果より、p40のプロモーター領域の転写開始点から上流約120bpに存在するNF-κB(#1)がCD40L-CD40を介した刺激によるp40発現誘導に重要であることが示唆された。現在さらに、CATアッセイを用いプロモーター活性での解析を検討中である。

IL-12 p40 mRNA 表达是由 CD40L-CD40 介导的刺激诱导的，今年我们在分子水平上分析了 p40 表达的这种诱导。首先，当用激动性抗CD40抗体刺激细胞表面强烈表达CD40的人B细胞肿瘤Daudi细胞时，通过RT-PCR和ELISA检测培养物上清液中p40表达在mRNA水平上增加。在蛋白质水平上进行了观察。此外，当与CD32(FcγRII)转染的L细胞共存并用激动性抗CD40抗体刺激时，该产量增加，并且甚至当用CD40L表达载体瞬时转染时，观察到更高的p40产量。因此，我们使用这些 Daudi 细胞进行了分析。首先，制备包含位于转录起始点上游约 120 bp 和 200 bp 处的 NF-kB 位点（分别为 #1 和 #2）的约 30 聚体寡核苷酸，并从用激动性抗-刺激的 Daudi 细胞中提取细胞核。当使用寡核苷酸进行凝胶位移测定时，使用含有 NF-κB (#1) 的寡核苷酸观察到结合产物的形成，但使用 NF-κB (#2) 则未观察到。此外，这种与 NF-κB(#1) 的结合会被过量的未标记寡核苷酸和 MHC ClassI 中含有真实 NF-κB 位点的寡核苷酸抑制，并且该 NF-κB(#1) 位点被发现含有 NF 突变的寡核苷酸-κB 没有被抑制，并且使用各种针对 NF-κB 的抗体进行的抑制实验表明，这种键的形成是特异性的。动力学分析还表明，即使在刺激后 15 分钟也能观察到这种结合。上述结果表明，存在于p40启动子区转录起始点上游约120bp处的NF-κB(#1)对于通过CD40L-CD40刺激诱导p40表达是重要的。我们目前正在考虑使用 CAT 分析来分析启动子活性。