Cre-loxP系を応用した哺乳動物胚における新しい細胞系譜解析法の開発

使用 Cre-loxP 系统开发哺乳动物胚胎新细胞谱系分析方法

• 批准号: 11876060
• 负责人: 木村 穣
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Tokai University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11876060/
• 关键词: Cre-loxP系; EGFP; lacZ; 細胞系譜; マウス; 着床前胚; レポーター遺伝子; Cre; loxP系; 胚盤胞

本実験はCre/loxP系を応用し、哺乳動物胚における細胞系譜解析の可能性を検討することを目的とする。既にtesterマウス系統として、CETZ-17 transgene[CAG(cytomegalovirus enhancer/chicken β-actin promoter),loxP/EGFP(enhanced green fluorescent protein)cDNA-CAT(chloramphenicol acetyltransferase)gene/loxP,lacZ gene(β-galactosidaseをコード)を内蔵]を有するtransgenic mouse(Tg)系統155-4を得た。この系統由来の着床前胚、例えば、2-cell胚の一つの割球の核にCre発現ベクターを顕微注入し、発生した4-to 8-cell胚をlacZの基質であるX-Gal存在下で染色すると胚の半分の細胞は青染された。これは、Creの発現でCETZ-17 transgene内のloxPで挟まれたEGFP-CAT配列が除去され、その下流側にあったlacZ遺伝子がCAG promoterの影響で発現するようになったことを意味し、本系が細胞系譜解析に活用出来ることが判明した(Sato et al.,Mol.Reprod.Develop.53,34-44,2000)。更に、CETZ-17Tg由来の胚におけるCre-loxP系を介したlacZ reporter遺伝子の発現誘導は、CETZ-17マウスとCreを脳特異的に発現するMNCEマウス系統(Sato et al.,Mol.Reprod.Dev.60,446-456,2001)とを掛け合わせることにより、着床後期でも、adult organでも起こることが確認され、本系の有効性が再確認された。本課題の一つは、マウス胚の着床前後における細胞系譜の解析にある。着目したのは、8-cell胚。8-cell胚は未だ分化全能性を示し、決定は行われていないとされる。しかし、16-cell胚になると、胚の外側に面した割球は将来栄養外胚葉細胞(TE)に分化し、胚の内側に入った割球は将来の胚体になる内部細胞塊(ICM)へ分化すると言われている。その分岐は、8-cell胚割球が横に分裂するか、縦に分裂するかに依存する。前者では、全ての嬢細胞がTEになり、後者では一つ(外側に面した割球)がTE、もう一つ(内側に面した割球)はICMとなる。8-cell胚の一つの割球の核にCre発現ベクターDNAを顕微注入し、翌日胚盤胞期をX-Galで染色すると、検討した胚全てが栄養外胚葉細胞の青染を示した。このことは、8-cell胚の割球の殆どは栄養外胚葉細胞への分化へ進む分裂の仕方、即ち、横方向への分裂をすると思われる。8-cell期では16-cell期へ分裂する間、横の分裂が最初に起こり、その後からICM細胞を作る縦の分裂が起こる可能性が示唆された。

该实验使用CRE/LOXP系统来研究哺乳动物胚胎中细胞谱系分析的可能性。转基因小鼠（TG）菌株155-4已经拥有CETZ-17转基因[CAT（巨细胞病毒增强子/鸡肉β-肌动蛋白启动子），LOXP/EGFP（增强的绿色荧光蛋白），CDNA-CAT，CDNA-CAT（氯基苯甲酸酯乙酰基转移酶），LACZ GENE，LACESTRACTβ基因（codemol actylansement gene gene gotosedβ）。当该谱系的胚胎的核（例如，2细胞胚胎）与CRE表达载体进行了微注射，其中一个2细胞胚胎中的胚胎胚核中的核核中，生成的4至8细胞胚胎在X-Gal中染色为X-gal，subtrate for X-gal，subtrate for lacz，lac的一半，是embryo的一半。这意味着CRE表达除去了CETZ-17转换中LOXP之间的EGFP-CAT序列，并且下游LACZ基因通过CAG启动子的影响表达，并且发现该系统可用于细胞谱系分析（Sato等人，Mol。Reprod。repred。Eprod。repred。53,34-4444444,44,44,2000）。此外，通过将CETZ-17小鼠用MNCE小鼠菌株繁殖，该小鼠菌株专门表达源自CETZ-17TG的胚胎中的Cre-loxp，可以证实，通过CRE-LOXP系统诱导LACZ报告基因的表达在晚期植入和成人器官中发生，并在此系统中发生。挑战之一是在植入小鼠胚胎之前和之后分析细胞谱系。重点是8细胞胚胎。 8细胞的胚胎仍然显示出分化的墓葬性，并且没有做出确定。但是，当涉及16细胞的胚胎时，面向胚胎外部的胚泡将来会区分滋养膜细胞（TE），而进入胚胎内部内部的胚泡将分化为内部细胞质量（ICM），将成为未来的胚胎。分支取决于8细胞胚胎囊泡仪是水平还是垂直分裂的。在前者中，所有女士的细胞都变成te，在后者中，一个（朝外的胚孔面）变成te，另一个（朝内的胚胎面孔）变成ICM。将CRE表达载体DNA显微注射到一个8细胞胚胎中的一个胚瘤的核中，第二天用X-GAL染色胚泡阶段，所有检查的胚胎均显示了滋养剂细胞的蓝色染色。这似乎会导致大多数囊泡分裂的大多数分裂的方式，该胚胎逐渐分化为分化为滋养外胚层细胞。有人提出，横向分裂首先在分裂为16细胞相的8细胞期间首先发生，然后可能发生产生ICM细胞的垂直分裂。

项目成果

M.Sato: "Direct injection of foreign DNA into mouse testis as a possible in vivo gene transfer system via epididymal spermatozoa"Molecular Reproduction and Development. 61. 49-56 (2001)

M.Sato：“通过附睾精子将外源 DNA 直接注射到小鼠睾丸中作为可能的体内基因转移系统”分子复制和发育。

M. Sato: "Cre-loxP System Confers Cell Lineage-Specific Expression of a Reporter Gene in Murine Preimplantation Development"Journal of Reproduction and Development. 45・6. 411-417 (1999)

M. Sato：“Cre-loxP 系统在小鼠植入前发育中赋予细胞谱系特异性表达”《生殖与发育杂志》45・6（1999 年）。

K.Isoda: "Myocardial hypertrophy in transgenic mice overexpressing human interleukin 1α"Journal of Cardiac Failure. (in press). (2001)

K.Isoda：“过度表达人白细胞介素 1α 的转基因小鼠的心肌肥大”《心脏衰竭杂志》（2001 年出版）。

M.Sato: "Intrabursal transfer of spermatozoa(ITS):A new route for artificial insemination of mice"Theriogenology. 55. 1881-1890 (2001)

M.Sato：“精子囊内转移（ITS）：小鼠人工授精的新途径”动物发生学。

M.Sato: "Usefulness of double gene construct for rapid identification of transgenic mice exhibiting tissue-specific gene expression"Molecular Reproduction and Development. 60. 446-456 (2001)

M.Sato：“双基因构建体对于快速鉴定表现出组织特异性基因表达的转基因小鼠的有用性”分子复制和发育。