受精後の初期発生プログラムに連動するポリA鎖伸長母性RNAの網羅的アプローチ

多聚 A 链延长母体 RNA 与受精后早期发育程序相关的综合方法

• 批准号: 13202059
• 负责人: 木村 穣
• 金额: $ 2.56万
• 依托单位: Tokai University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13202059/
• 关键词: マウス; 着床前初期胚; 卵形成; 受精卵; 母性RNA; 接合型遺伝子発現; poly(A)鎖付加; 翻訳制御

多くの生物の受精卵初期発生には、必ず母性型RNAから接合子型RNAへの発現の転換があり、このシステムが正常に作動しない限り、以降の発生プログラムは進行しない。この時期に対応する新たな現象として、我々は、ある母性RNAが受精後18時間(1細胞期後期)をピークとして一過的にそのmRNAのポリA鎖を伸長させ、その後分解されることを初めて見いだした。現在、我々の他に7遺伝子で同様の現象が報告されており、受精後に生じる母性RNAのポリA鎖伸長現象が、マウス初期胚発生プログラム発動に重要な役割を演じている可能性が示唆されている。我々の目的は、同様の動態を示す母性RNAを網羅的単離し、解析をすることにより受精直後の初期胚の遺伝子発現転換を中心とした発生システムの解明に挑むことを目的とした。そのため、ポリA鎖伸長を起こした母性RNA群のみを濃縮した我々独自のcDNALibrary作製法を考案し、本年度、その作製条件7項目を検討した。(a)biotinATPのマウス受精卵への導入方法(Permeabilization、Electroporationおよび胚注入法)の検討。(b)胚注入するbiotinATPの濃度の決定。(c)ポリA)鎖伸長を示すRNA群の免疫蛍光抗体法によるマウス受精卵上での視覚化。(d)(c)の手法を活用したbiotinATPの胚注入時間の設定。(e)biotinATP注入胚からbiotinラベルRNA群の単離法の確立。(f)streptavidin架橋ビーズに回収されたRNAからRT-PCRを用いたcDNAの増幅条件の設定。(g)増幅されたcDNAの品質検討。その結果、最適条件を用いてマウス初期胚にATP誘導体を取り込ませポリA鎖伸長を引き起こしている母性RNAのみを濃縮したcDNA群の増幅に成功した。

在许多生物体受精卵的早期发育过程中，总是存在从母体RNA到合子RNA表达的转换，除非这个系统正常运行，否则后续的发育程序将无法进行。作为与这一时期相对应的新现象，我们首次发现某种母体RNA的mRNA多聚A链短暂延长，在受精后18小时（单细胞阶段晚期）达到峰值，然后被降解。目前，在除我们之外的七个基因中也报道了类似的现象，这表明受精后发生的母体RNA的polyA链的延长可能在小鼠早期胚胎发育程序的启动中发挥重要作用。我们的目的是全面分离和分析表现出类似动态的母体RNA，以阐明受精后早期胚胎中以基因表达转换为中心的发育系统。因此，我们设计了一种独特的cDNALibrary生产方法，仅浓缩经过polyA链延伸的母体RNA组，今年我们研究了其生产的7个条件。 (a)研究将生物素ATP导入小鼠受精卵的方法(透化法、电穿孔法、胚胎注射法)。 (b) 确定注射到胚胎中的生物素ATP 浓度。 (c)通过免疫荧光抗体方法对小鼠受精卵上显示多聚A)链延长的RNA组进行可视化。 (d)使用(c)中的方法设定生物素ATP的胚胎注射时间。 (e)建立从注射生物素ATP的胚胎中分离生物素标记的RNA组的方法。 (f) 设置使用 RT-PCR 从链霉亲和素交联珠上回收的 RNA 进行 cDNA 扩增的条件。 (g) 扩增 cDNA 的质量检查。结果，在最佳条件下，我们成功地扩增了仅富含母体 RNA 的 cDNA 组，该母体 RNA 通过将 ATP 衍生物掺入早期小鼠胚胎中而导致多聚 A 链延长。

项目成果

Shiina, T., Ando, A., et al.: "Genomic Anatomy of a Premier Major Histocompatibility Complex Paralogous Region on Chromosome 1q21-22"Genome Research. 11. 789-802 (2001)

Shiina, T.、Ando, A. 等人：“染色体 1q21-22 上首要主要组织相容性复杂旁系同源区域的基因组解剖”基因组研究。

Kajiwara, K., O-Wang, J., Sakurai, T. et al.: "Sez4 gene encoding an elongation subunit of DNA polymerase zeta is required for normal embyogenesis"Genes to Cells. 6. 99-106 (2001)

Kajiwara, K.、O-Wang, J.、Sakurai, T. 等人：“正常胚胎发生需要编码 DNA 聚合酶 zeta 延伸亚基的 Sez4 基因”Genes to Cells。

Kawamura. K., O-Wang. J. et. al.: "The error-prone DNA polymerase zeta catalytic subunit(Rev3) gene is ubiquitously expressed in normal and malignant human tissues"Int.J.Oncology. 18. 97-103 (2001)

川村。