受精後の初期発生プログラムに連動するポリA鎖伸長母性RNAの網羅的アプローチ

多聚 A 链延长母体 RNA 与受精后早期发育程序相关的综合方法

• 批准号: 13202059
• 负责人: 木村 穣
• 金额: $ 2.56万
• 依托单位: Tokai University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13202059/
• 关键词: マウス; 着床前初期胚; 卵形成; 受精卵; 母性RNA; 接合型遺伝子発現; poly(A)鎖付加; 翻訳制御

多くの生物の受精卵初期発生には、必ず母性型RNAから接合子型RNAへの発現の転換があり、このシステムが正常に作動しない限り、以降の発生プログラムは進行しない。この時期に対応する新たな現象として、我々は、ある母性RNAが受精後18時間(1細胞期後期)をピークとして一過的にそのmRNAのポリA鎖を伸長させ、その後分解されることを初めて見いだした。現在、我々の他に7遺伝子で同様の現象が報告されており、受精後に生じる母性RNAのポリA鎖伸長現象が、マウス初期胚発生プログラム発動に重要な役割を演じている可能性が示唆されている。我々の目的は、同様の動態を示す母性RNAを網羅的単離し、解析をすることにより受精直後の初期胚の遺伝子発現転換を中心とした発生システムの解明に挑むことを目的とした。そのため、ポリA鎖伸長を起こした母性RNA群のみを濃縮した我々独自のcDNALibrary作製法を考案し、本年度、その作製条件7項目を検討した。(a)biotinATPのマウス受精卵への導入方法(Permeabilization、Electroporationおよび胚注入法)の検討。(b)胚注入するbiotinATPの濃度の決定。(c)ポリA)鎖伸長を示すRNA群の免疫蛍光抗体法によるマウス受精卵上での視覚化。(d)(c)の手法を活用したbiotinATPの胚注入時間の設定。(e)biotinATP注入胚からbiotinラベルRNA群の単離法の確立。(f)streptavidin架橋ビーズに回収されたRNAからRT-PCRを用いたcDNAの増幅条件の設定。(g)増幅されたcDNAの品質検討。その結果、最適条件を用いてマウス初期胚にATP誘導体を取り込ませポリA鎖伸長を引き起こしている母性RNAのみを濃縮したcDNA群の増幅に成功した。

在许多生物体中受精卵的早期发育中，总是会从母体RNA转化为孕妇RNA到合子RNA，除非该系统正常运行，否则随后的发育程序不会进行。在与此期间相对应的新现象中，我们首次发现母体RNA在18小时（一个细胞阶段晚期）峰，然后发展为mRNA的Polya链，然后降解。除了我们之外，其他七个基因也报道了类似的现象，这表明受精后发生的poly-A链扩展现象可能在小鼠早期胚胎发育计划的激活中起重要作用。我们的目的是全面分离和分析表现出相似动力学的母体RNA，并阐明发育系统，重点关注受精后早期胚胎中的基因表达转化。因此，我们设计了自己的CDnalibrary生产方法，该方法仅丰富了具有Polya链扩展的母体RNA组，并研究了今年的七个条件。 （a）检查用于将生物纳塔普引入小鼠受精卵的方法（透明，电穿孔和注射胚胎）。 （b）确定生物纳atp注入胚胎的浓度。 （c）通过免疫荧光免疫荧光在小鼠受精卵上显示polya链的RNA组的可视化。 （d）使用（c）中的方法设定生物纳塔普的胚胎注射时间。 （e）建立一种从生物尼亚抗胚胎中分离出生物素标记的RNA基团的方法。 （f）使用RT-PCR从链霉亲和素交联珠中回收的RNA的cDNA设置放大条件。 （g）放大cDNA的质量研究。结果，我们成功地放大了一个cDNA基团，其中将ATP衍生物掺入了早期小鼠胚胎中，并仅富集了使用最佳条件的polya链延伸的母体RNA。

项目成果

Shiina, T., Ando, A., et al.: "Genomic Anatomy of a Premier Major Histocompatibility Complex Paralogous Region on Chromosome 1q21-22"Genome Research. 11. 789-802 (2001)

Shiina, T.、Ando, A. 等人：“染色体 1q21-22 上首要主要组织相容性复杂旁系同源区域的基因组解剖”基因组研究。

Kajiwara, K., O-Wang, J., Sakurai, T. et al.: "Sez4 gene encoding an elongation subunit of DNA polymerase zeta is required for normal embyogenesis"Genes to Cells. 6. 99-106 (2001)

Kajiwara, K.、O-Wang, J.、Sakurai, T. 等人：“正常胚胎发生需要编码 DNA 聚合酶 zeta 延伸亚基的 Sez4 基因”Genes to Cells。

Kawamura. K., O-Wang. J. et. al.: "The error-prone DNA polymerase zeta catalytic subunit(Rev3) gene is ubiquitously expressed in normal and malignant human tissues"Int.J.Oncology. 18. 97-103 (2001)

川村。