モーター蛋白質アクトミオシンの結晶化とX線とESRによる分子構造解析

运动蛋白肌动球蛋白的结晶以及使用 X 射线和 ESR 的分子结构分析

基本信息

批准号：
11156218
负责人：
荒田敏昭
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は筋収縮のエネルギー変換を蛋白質の分子構造に立脚して理解するために、最小単位であるアクチン単、2量、3量体とミオシン頭部の複合体のX線散乱実験とモーター蛋白用にESR精密角度計測を行った。Gアクチンを化学修飾し、全く重合しないがミオシンと結合するアクチンモノマーを調製し、ミオシン頭部S1との1:1複合体を形成させ、複合体のみの散乱強度曲線を得ることに成功していた。アクチン、S1の原子座標を用いて全散乱強度曲線を最適化するドッキング原子モデルを計算機により探索したところ、我々の電顕写真観察で予想されるように、S1先端近くにアクチンが結合することが確定した。ADP中でも解離を最小限に抑えた条件で同様の実験することに成功し、分子量は変わらず慣性半径が約3-4オングストロームだけ小さくなった。モデル計算ではS1が長軸のまわりに90度以上回転した。この結果はATP加水分解中のアクチン-ミオシンの弱い結合の本体を捉えたものと考えれた。今年度はアクチン2量体、3量体を作成し、さらに高次の構造を解析した。重合しない2量体、3量体ともKI中の化学修飾で得られた。低イオン強度ではモノマーと同様1:1複合体を形成し、2:2、3:3複合体ができた。一方90mMKClでは2:1、3:1複合体ができた。また複合体形成によるATP分解促進やATPによる結合強度の変化も認められなかった。90mMKCIにおける2:1または3:1複合体のX線散乱実験も成功し解析を始めた。アクチン・ミオシン複合体モノマーの結晶化も精力的に押し進めているがまだ成功には至っていない。モーター蛋白用高感度ESR測定のためループギャップ共振器を試作し、コンピューター信号処理システムによりスペクトルを記録し引続き調整中である。最近はミオシンネック軽鎖に結合したスピンラベルのESRスペクトルを頭部2つから由来するスペクトル和として精密fitした。その結果弛緩状態でもミオシン頭部は2方向に緩く配向していると考えられる。

为了了解基于蛋白质分子结构的肌肉收缩的能量转换，我们对肌动蛋白、二聚体和三聚体的最小单位以及肌球蛋白头的复合物进行了X射线散射实验，并使用了ESR精度。进行了角度测量。我们对G-肌动蛋白进行化学修饰，制备出完全不聚合但与肌球蛋白结合的肌动蛋白单体，与肌球蛋白头S1形成1:1复合物，并成功获得了仅该复合物的散射强度曲线。当我们通过计算搜索使用肌动蛋白和 S1 的原子坐标优化总散射强度曲线的对接原子模型时，我们发现肌动蛋白在 S1 尖端附近结合，正如我们的电子显微照片观察所证实的那样。在最大限度地减少解离的条件下，在 ADP 中成功进行了类似的实验，并且回转半径减少了约 3-4 埃，而分子量保持不变。模型计算中，S1绕长轴旋转了90度以上。这一结果被认为抓住了 ATP 水解过程中弱肌动蛋白-肌球蛋白键的本质。今年，我们创建了肌动蛋白二聚体和三聚体，并分析了高阶结构。二聚体和三聚体均不聚合，是在 KI 过程中通过化学修饰获得的。在低离子强度下，它像单体一样形成1:1络合物，然后形成2:2和3:3络合物。另一方面，与90mMKCl形成2:1和3:1复合物。此外，既没有观察到由于复合物形成而促进ATP降解，也没有观察到由于ATP而导致结合强度的变化。 90mMKCI 中 2:1 或 3:1 复合物的 X 射线散射实验也取得了成功，分析已经开始。尽管人们正在努力结晶肌动蛋白-肌球蛋白复合物单体，但尚未取得成功。我们已经制作了用于运动蛋白高灵敏度 ESR 测量的环隙谐振器原型，使用计算机信号处理系统记录光谱，并且仍在进行调整。最近，与肌球蛋白颈轻链结合的自旋标签的 ESR 光谱被精确拟合为来自两个头的光谱之和。因此，即使在放松状态下，肌球蛋白头也被认为是松散地定向在两个方向上。