分子モータ・アクトミオシンのESRによる動的構造解析とその結晶化

ESR及其结晶对分子运动肌动球蛋白的动态结构分析

基本信息

批准号：
09279223
负责人：
荒田敏昭
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は筋収縮のエネルギー変換を蛋白質の分子構造に立脚して理解するために、最小単位であるアクチンとミオシン頭部の単量体コンプレックスのX線散乱実験とモーター蛋白用にESR技術改良を行った。Gアクチンをマレイミドベンゼン酸エステル、ジアゾニウムテトラゾルで化学修飾した結果、全く重合しないがミオシンと結合するアクチンモノマーを調製し、ミオシン頭部S1との1:1複合体を形成させることに成功した。さらに可逆的に強く結合したアクチン-S1複合体のみの散乱強度曲線は遊離アクチン、S1の散乱を補正して得られ混合モル比に関係せず一致した。算出した慣性半径は50オングストローム、分子量150kDa、最大分子コード長は180オングストローム、アクチン-S1重心間距離70-80オングストロームとなった。今年度はこれらを指標にしてアクチン、S1の原子座標を用いて散乱強度曲線を最適化するドッキング原子モデルを計算機により探索したところ、S1先端近くにアクチンが結合することが確定した。小さいドメイン間内部運動を考慮することにより完全にフィットできた。ATPの場合は複合体の解離がおこってしまい解析不能であったが、ADPでは解離を最小限に抑えた条件で同様の実験することに成功した。その結果、分子量は殆ど変わらず慣性半径が約3-4オングストロームだけ小さくなった。モデル計算ではS1が長軸のまわりに90度以上回転した。この結果はS1の2つの結合部位のち一方は隣接アクチンだけでなくもう一方の結合部位とともに同じアクチンと相互作用できることを示唆する。現在これらのモデルがユニークかどうかマーカー蛋白(DNaseI,軽鎖)を結合させて実験中である。アクチン・ミオシン複合体モノマーの結晶化も精力的に押し進めているがまだ成功には至っていない。モーター蛋白用高感度SRE測定のためループギャップ共振器を試作中である。

为了了解基于蛋白质分子结构的肌肉收缩的能量转换，我们对最小单位肌动蛋白和肌球蛋白头的单体复合物进行了X射线散射实验，并改进了运动蛋白Ta的ESR技术。。通过用马来酰亚胺苯酸酯和重氮四唑对G-肌动蛋白进行化学修饰，我们成功制备了一种完全不聚合但与肌球蛋白结合的肌动蛋白单体，并与肌球蛋白头S1形成1:1复合物。此外，通过校正游离肌动蛋白和S1的散射，仅获得强可逆结合的肌动蛋白-S1复合物的散射强度曲线，并且无论混合摩尔比如何，它都匹配。计算得到的惯性半径为50埃，分子量为150 kDa，最大分子绳长度为180埃，肌动蛋白-S1质心之间的距离为70-80埃。今年，我们以这些为指标，利用计算机搜索对接原子模型，利用肌动蛋白和S1的原子坐标优化散射强度曲线，并确定肌动蛋白在S1尖端附近结合。通过考虑小的域间内部运动实现了完美的拟合。对于 ATP，发生了复杂的解离，无法进行分析，但对于 ADP，我们成功地在最小化解离的条件下进行了类似的实验。结果，回转半径减少了约3-4埃，而分子量几乎保持不变。模型计算中，S1绕长轴旋转了90度以上。这一结果表明，S1 的两个结合位点之一可以与同一肌动蛋白相互作用，不仅可以与相邻的肌动蛋白相互作用，还可以与另一个结合位点相互作用。我们目前正在进行实验，通过附加标记蛋白（DNase I，轻链）来确定这些模型是否独特。尽管人们正在努力结晶肌动蛋白-肌球蛋白复合物单体，但尚未取得成功。我们目前正在开发一种原型环隙谐振器，用于运动蛋白的高灵敏度 SRE 测量。