アクチン・ミオシン複合体のX線溶液散乱と結晶化

肌动蛋白-肌球蛋白复合物的X射线溶液散射和结晶

基本信息

批准号：
08214207
负责人：
若林克三
金额：
$ 0.77万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は筋収縮のエネルギー交換を蛋白質の分子構造に立脚して理解するために、最小単位であるアクチンとミオシン頭部の単量体コンプレックスを調製し、その結晶化とX線結晶構造解析ならびに溶液X線散乱構造解析を併用してエネルギー交換中のアクトミオシン分子の原子構造解明を目指した。昨年度まではGアクチンをマレイミドベンゼン酸エステル、ジアゾニウムテトラゾルで化学修飾した結果、全く重合しないがミオシンと結合するアクチンモノマーを調製し、ミオシン頭部S1との1:1複合体を形成させることに成功した。さらに可逆的に強く結合したアクチン-S1複合体のみの散乱強度曲線は遊離アクチン、S1の散乱を補正して得られ混合モル比に関係せず一致した。算出した慣性半径は50オングストローム、分子量150kDa、最大分子コード長は180オングストローム、アクチン-S1重心間距離70-80オングストロームとなった。今年度はこれらを指標にしてアクチン、S1の原子座標を用いて散乱強度曲線を最適化するドッキング原子モデルを計算機により探索したところ、S1先端近くにアクチンが結合することが確定した。しかし完全な一致は得られないので、水分子の配位、ドメイン間内部運動などモデル計算により検討している。次にATPやADPにより複合体分子のモーター活性に関する興味ある構造変化がおこるか調べた。ATPの場合は複合体の解離がおこってしまい解析不能であったが、ADPでは解離を最小限に抑えた条件で同様の実験することに成功した。その結果、分子量は殆ど変わらず慣性半径が約3-4オングストロームだけ小さくなった。このことが分子間結合位置の変位(ずれ)によるのかS1内部運動によるのかを明かにするため精密な解析を現在行っているところである。アクチン・ミオシン複合体モノマーの結晶化も精力的に押し進めているがまだ成功には至っていない。しかしこれらの試料のX線溶液散乱実験と解析は著しい進展を遂げたと確信している。

为了根据蛋白质的分子结构了解肌肉收缩的能量交换，我们制备了肌动蛋白和肌球蛋白头（最小单位）的单体复合物，并进行了结晶、X射线晶体结构分析和溶液分析我们的目的是利用 X 射线散射结构分析来阐明能量交换过程中肌动球蛋白分子的原子结构。直到去年，通过用马来酰亚胺苯酸酯和重氮四唑对G-肌动蛋白进行化学修饰，我们能够制备出完全不聚合但与肌球蛋白结合的肌动蛋白单体，与肌球蛋白头S1形成1:1的复合物成功了。此外，通过校正游离肌动蛋白和S1的散射，仅获得强可逆结合的肌动蛋白-S1复合物的散射强度曲线，并且无论混合摩尔比如何，它都匹配。计算得到的惯性半径为50埃，分子量为150 kDa，最大分子绳长度为180埃，肌动蛋白-S1质心之间的距离为70-80埃。今年，我们以这些为指标，利用计算机搜索对接原子模型，利用肌动蛋白和S1的原子坐标优化散射强度曲线，并确定肌动蛋白在S1尖端附近结合。然而，由于无法获得完美的一致性，我们正在通过模型计算研究水分子的协调和域之间的内部运动。接下来，我们研究了 ATP 或 ADP 是否会引起与复杂分子的运动活动相关的有趣的结构变化。对于 ATP，发生了复杂的解离，无法进行分析，但对于 ADP，我们成功地在最小化解离的条件下进行了类似的实验。结果，回转半径减少了约3-4埃，而分子量几乎保持不变。我们目前正在进行精确分析，以确定这是由于分子间键位置的位移（滑移）还是S1的内部移动造成的。尽管人们正在努力结晶肌动蛋白-肌球蛋白复合物单体，但尚未取得成功。然而，我们相信这些样品的 X 射线溶液散射实验和分析已经取得了重大进展。