アクチン・ミオシン頭部複合体の結晶化とX線回析

肌动蛋白-肌球蛋白头复合物的结晶和X射线衍射

基本信息

批准号：
07224206
负责人：
若林克三
金额：
$ 0.9万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は筋収縮のエネルギー変換を蛋白質の分子構造に立脚して理解するために、最小単位であるアクチンとミオシン頭部の単量体コンプレックスを調製し、その結晶化とX線結晶構造解析ならびに溶液X線散乱による溶液構造解析を併用してエネルギー変換中のアクトミオシン分子の構造解明を目指した。昨年度はG-アクチンを二価性架橋剤マレイミドベンゼン酸エステル(MBS)処理後、さらにサブドメインIIのチロシン53をジアゾニウムテトラゾル(DHT)で化学修飾した結果、ファロイジンを作用させても全く重合しないがミオシンと結合するアクチンモノマーを調製し、MBSによりアクチンとミオシン頭部S1との1:1架橋複合体を形成させることに成功した。今年度は架橋複合体と可逆結合したアクチンモノマー・S1複合体のX線溶液散乱実験をし、原子モデルを構築した。架橋複合体のX線溶液散乱実験から算出した分子の形態を表す慣性半径はS1単独(40オングストローム)より著しく大きく、約60オングストローム、原子散乱強度から求めた分子量は300kDa近くあり、推定分子量(150kDa)の約2倍あり比較的高濃度蛋白溶液中では複合体ダイマーと考えられた。一方混合して可逆的に強く結合したアクチン-S1複合体のみの散乱強度分布は遊離アクチン、S1を補正すると混合モル比に関係せず一致した。算出した慣性半径は50オングストローム、分子量150kDa、最大分子コード長は180オングストローム、アクチン-S1重心間距離70-80オングストロームとなった。これらを指標にしてアクチン、S1の原子座標を用いて散乱強度分布を最適化するドッキングモデルをコンピューターにより探索したところ、S1先端近くにアクチンが結合することが確定した。しかし完全な一致は得られないので、この違いが何によるのか水分子の配位、ドメイン間内部運動などモデル起算により検討している。以上、現在までアクチン・ミオシン複合体モノマーの結晶化には至っていないが、これらの試料のX線溶液散乱実験はかなり進展した。現在結晶化を精力的に押し進めている。

为了了解基于蛋白质的分子结构的肌肉收缩的能量转化，我们准备了肌动蛋白和肌球蛋白头部的单体复合物，这是最小的单位，旨在通过使用X射线晶体分析和溶液X射线分析组合，旨在阐明在能量转化过程中肌动肌球蛋白分子的结构。 Last year, after treating G-actin with bivalent crosslinker maleimidebenzene acid ester (MBS), the subdomain II tyrosine 53 was chemically modified with diazonium tetrazole (DHT), and as a result, an actin monomer that does not polymerize at all when phalloidin is applied, but binds to myosin, was successfully formed by MBS to form a 1:1 crosslinked肌动蛋白和肌球蛋白头S1之间的复杂性。今年，我们对肌动蛋白单体/S1复合物进行了X射线溶液散射实验，这些实验可可逆地与交联的复合物绑定以构建原子模型。代表由X射线溶液散射实验计算的分子形态的惯性半径明显大于单独的S1（40埃埃斯特罗姆），并且由原子散射强度确定的分子量接近300 kDa，约为300 kDa，约为估计的分子量（150 kDa），使其浓度较高。另一方面，当自由肌动蛋白和S1的混合摩尔比校正自由肌动蛋白和S1时，仅肌动蛋白-S1复合物的散射强度分布是一致的。计算出的惯性半径为50埃，分子量为150 kDa，最大分子绳长度为180埃，肌动蛋白 - S1重心距离为70-80埃埃斯特罗姆。使用这些索引，我们使用对接模型使用肌动蛋白和S1的原子坐标来优化散射强度分布，并证实肌动蛋白在S1的尖端附近结合。但是，没有获得完美匹配，因此我们通过模型计算进行了研究，例如水分子的协调和域间运动。尽管迄今尚未结晶，但肌动蛋白膜蛋白复合物单体在这些样品上的X射线溶液散射实验中取得了很大进展。目前，他们正在积极通过结晶前进。