アクチン・ミオシン頭部複合体の結晶化とX線回析

肌动蛋白-肌球蛋白头复合物的结晶和X射线衍射

基本信息

批准号：
07224206
负责人：
若林克三
金额：
$ 0.9万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は筋収縮のエネルギー変換を蛋白質の分子構造に立脚して理解するために、最小単位であるアクチンとミオシン頭部の単量体コンプレックスを調製し、その結晶化とX線結晶構造解析ならびに溶液X線散乱による溶液構造解析を併用してエネルギー変換中のアクトミオシン分子の構造解明を目指した。昨年度はG-アクチンを二価性架橋剤マレイミドベンゼン酸エステル(MBS)処理後、さらにサブドメインIIのチロシン53をジアゾニウムテトラゾル(DHT)で化学修飾した結果、ファロイジンを作用させても全く重合しないがミオシンと結合するアクチンモノマーを調製し、MBSによりアクチンとミオシン頭部S1との1:1架橋複合体を形成させることに成功した。今年度は架橋複合体と可逆結合したアクチンモノマー・S1複合体のX線溶液散乱実験をし、原子モデルを構築した。架橋複合体のX線溶液散乱実験から算出した分子の形態を表す慣性半径はS1単独(40オングストローム)より著しく大きく、約60オングストローム、原子散乱強度から求めた分子量は300kDa近くあり、推定分子量(150kDa)の約2倍あり比較的高濃度蛋白溶液中では複合体ダイマーと考えられた。一方混合して可逆的に強く結合したアクチン-S1複合体のみの散乱強度分布は遊離アクチン、S1を補正すると混合モル比に関係せず一致した。算出した慣性半径は50オングストローム、分子量150kDa、最大分子コード長は180オングストローム、アクチン-S1重心間距離70-80オングストロームとなった。これらを指標にしてアクチン、S1の原子座標を用いて散乱強度分布を最適化するドッキングモデルをコンピューターにより探索したところ、S1先端近くにアクチンが結合することが確定した。しかし完全な一致は得られないので、この違いが何によるのか水分子の配位、ドメイン間内部運動などモデル起算により検討している。以上、現在までアクチン・ミオシン複合体モノマーの結晶化には至っていないが、これらの試料のX線溶液散乱実験はかなり進展した。現在結晶化を精力的に押し進めている。

为了根据蛋白质的分子结构了解肌肉收缩的能量转换，我们制备了肌动蛋白和肌球蛋白头（最小单位）的单体复合物，并进行了结晶、X射线晶体结构分析和溶液分析我们的目的是通过使用 X 射线散射的溶液结构分析来阐明能量转换过程中肌动球蛋白分子的结构。去年，我们用二价交联剂马来酰亚胺苯（MBS）处理G-actin后，用重氮四唑（DHT）对子结构域II的酪氨酸53进行化学修饰，结果，即使当鬼笔环肽存在时，它也根本不聚合。我们制备了与肌球蛋白结合的肌动蛋白单体，并使用 MBS 成功在肌动蛋白和肌球蛋白头 S1 之间形成了 1:1 的交联复合物。今年，我们对肌动蛋白单体/S1复合物与交联复合物可逆结合进行了X射线溶液散射实验，并构建了原子模型。惯性半径代表由交联复合物的X射线溶液散射实验计算出的分子形态，明显大于单独的S1（40埃），约为60埃，并且由原子散射强度确定的分子量接近300 kDa，估计分子量（150 kDa），被认为是相对高浓度蛋白质溶液中的复杂二聚体。另一方面，当校正游离肌动蛋白和S1时，无论混合摩尔比如何，仅混合并强结合的肌动蛋白-S1复合物的散射强度分布可逆地匹配。计算得到的惯性半径为50埃，分子量为150 kDa，最大分子绳长度为180埃，肌动蛋白-S1质心之间的距离为70-80埃。以这些为指标，我们使用计算机搜索了利用肌动蛋白和S1的原子坐标优化散射强度分布的对接模型，并确定肌动蛋白在S1的尖端附近结合。然而，由于无法获得完美的一致性，我们正在使用水分子的协调和域之间的内部运动等模型来研究导致这种差异的原因。如上所述，虽然肌动蛋白-肌球蛋白复合物单体的结晶迄今为止尚未实现，但使用这些样品的X射线溶液散射实验已经取得了相当大的进展。目前，结晶工作正在积极推进中。