ESRとX線解析で捉える分子モーター・アクトミオシンの動的構造

ESR 和 X 射线分析捕获分子运动肌动球蛋白的动态结构

基本信息

批准号：
10175217
负责人：
荒田敏昭
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は筋収縮のエネルギー変換を蛋白質の分子構造に立脚して理解するために、最小単位であるアクチンとミオシン頭部の単量体コンプレックスのX線散乱実験とモーター蛋白用にESR技術改良を行った。Gアクチンを化学修飾し、全く重合しないがミオシンと結合するアクチンモノマーを調製し、ミオシン頭部S1との1:1複合体を形成させ、複合体のみの散乱強度曲線を得ることに成功していた。算出した慣性半径は50オングストローム、分子量165kDa、最大分子コード長は180オングストローム、アクチン-S1重心間距離72オングストロームとなった。今年度はこれらを指標にしてアクチン、S1の原子座標を用いて全散乱強度曲線を最適化するドッキング原子モデルを計算機により探索したところ、我々の電顕写真観察で予想されるように、S1先端近くにアクチンが結合することが確定した。しかしアクチンは対称軸を持つためS1がアクチンの4サブドメインそれぞれに結合する4つのモデルが残った。DNaseIを結合して非対称としたアクチンとS1複合体の実験により唯一のモデルが確定した。すなわちサブドメインIに結合するとき推定分子量、慣性半径は実験値(180kDa、50オングストローム)とよく一致した。さらに小さいドメイン間内部運動を考慮することにより完全にフィットできた。ADP中でも解離を最小限に抑えた条件で同様の実験することに成功し、分子量は変わらず慣性半径が約3-4オングストロームだけ小さくなった。モデル計算ではS1が長軸のまわりに90度以上回転した。この結果はS1の2つの主結合部位を回転中心とし第2の結合部位は隣接アクチンだけでなく主アクチンとも相互作用できることを示唆し、ATP加水分解中のアクチン-ミオシンの弱い結合の本体を捉えたものと考えれる。アクチン・ミオシン複合体モノマーの結晶化も精力的に押し進めているがまだ成功には至っていない。モーター蛋白用高感度ESR測定のためループギャップ共振器を試作し、コンピューター信号処理システムによりスペクトルを記録し調整中である。

为了了解基于蛋白质分子结构的肌肉收缩的能量转换，我们对最小单位肌动蛋白和肌球蛋白头的单体复合物进行了X射线散射实验，并改进了运动蛋白Ta的ESR技术。。我们对G-肌动蛋白进行化学修饰，制备出完全不聚合但与肌球蛋白结合的肌动蛋白单体，与肌球蛋白头S1形成1:1复合物，并成功获得了仅该复合物的散射强度曲线。计算出惯性半径为50埃，分子量为165 kDa，最大分子弦长为180埃，肌动蛋白-S1质心之间的距离为72埃。本财年，我们以这些为指标，寻找利用肌动蛋白和S1的原子坐标优化总散射强度曲线的对接原子模型，正如我们通过电子显微照片观察所预期的那样，我们发现S1的尖端得到了证实。肌动蛋白在附近结合。然而，由于肌动蛋白具有对称轴，因此保留了四种模型，其中 S1 与肌动蛋白的四个子结构域中的每一个结合。通过结合 DNaseI 使肌动蛋白和 S1 复合物形成不对称的实验，建立了一个独特的模型。也就是说，当与子结构域I结合时，估计的分子量和回转半径与实验值（180 kDa，50埃）非常吻合。通过考虑更小的域间内部运动，实现了完美的拟合。在最大限度地减少解离的条件下，在 ADP 中成功进行了类似的实验，并且回转半径减少了约 3-4 埃，而分子量保持不变。模型计算中，S1绕长轴旋转了90度以上。这一结果表明，S1的两个主要结合位点是旋转中心，第二个结合位点不仅可以与邻近的肌动蛋白相互作用，还可以与主肌动蛋白相互作用，并捕获ATP水解过程中弱肌动蛋白-肌球蛋白结合的主体可以认为是这样的东西。尽管人们正在努力结晶肌动蛋白-肌球蛋白复合物单体，但尚未取得成功。我们已经制作了用于运动蛋白高灵敏度 ESR 测量的环隙谐振器原型，目前正在使用计算机信号处理系统记录和调整光谱。