分子モーター蛋白アクチン-ミオシンのX線・ESRによる動的構造解析と結晶化

使用 X 射线和 ESR 对分子运动蛋白肌动蛋白-肌球蛋白进行动态结构分析和结晶

基本信息

批准号：
12030218
负责人：
荒田敏昭
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は筋収縮のエネルギー変換を蛋白質の分子構造に立脚して理解するために、最小単位であるアクチン単、2量、3量体とミオシン頭部の複合体のX線散乱実験とモーター蛋白用にESR精密角度計測を行った。Gアクチンを化学修飾し、全く重合しないがミオシンと結合するアクチンモノマーを調製し、ミオシン頭部S1との1:1複合体を形成させ、X線溶液散乱強度パターンのモデル計算フィットではアクチンモノマー分子上で、S1が長軸のまわりに90度以上回転した。この結果はATP加水分解中のアクチン-ミオシンの弱い結合の本体を捉えたものと考えれた。今年度はアクチン2量体、3量体を作成し、さらに高次の構造を解析した。重合しない2量体、3量体ともKl中の化学修飾で得られた。90mMKClでは2:1、3:1複合体ができた。また複合体形成によるATP分解促進やATPによる結合強度の変化も認められなかった。90mMKClにおける2:1または3:1複合体のX線散乱実験も成功し解析を始めた。その結果、アクチン単独では1、2または3量体×2を形成し、S1との結合で×2は解離し、1、2または3量体に1個のS1が結合すると解釈できた。アクチン・ミオシン複合体モノマーの結晶化も精力的に押し進めているがまだ成功には至っていない。モーター蛋白用高感度ESR測定のためループギャップ共振器を試作し、引続き調整中である。最近はミオシンネック軽鎖に結合したスピンラベルのESRスペクトルを頭部2つから由来するスペクトル和として精密fitした。それ以外の可能性(ランダム+単一角度)も検定したがフィットは悪かった。チューブリン(TU)結合部位の側鎖のスピンラベルはTUへのキネシン結合の飽和度に依存し、協同的に束縛を受けた。このことはキネシンの方向性のある運動が、TUサブユニット間で構造的に生じる結合強度の空間差によるという仮説を支持した。

为了了解基于蛋白质的分子结构的肌肉收缩的能量转化，我们对运动蛋白进行了X射线散射实验和ESR精度角度测量，这是肌动蛋白单，双，三合一和肌球蛋白头复合物的最小单位。 G-肌动蛋白是化学修饰的，以制备根本没有聚合的肌动蛋白单体，但可以与肌球蛋白结合，与肌球蛋白头S1形成1：1复合物，并且在模型计算中，X射线溶液溶液散射强度模式的计算拟合，S1在Actin Monomer Molecule上旋转了90度的长轴。人们认为该结果可以捕获ATP水解过程中肌动蛋白肌球蛋白的弱结合体。今年，创建了肌动蛋白二聚体和三聚体，并分析了高阶结构。通过KL中的化学修饰获得了非聚合二聚体和三聚体。 90mm KCl产生2：1和3：1的复合体。此外，由于复杂形成或ATP而导致的ATP引起的结合强度没有变化。 2：1或3：1的X射线散射实验在90 mM KCL中也成功，并且开始了分析。结果，单独的肌动蛋白形成1、2或三聚体X2，当它与S1、2或三聚体绑定时，×2分离剂，并且可以解释为与一个S1结合到一个S1与1、2或三聚体。肌动蛋白 - 肌球蛋白复合物单体的结晶也已经大力推动，但尚未成功。对循环间隙谐振器进行了原型型，用于高度敏感的运动蛋白ESR测量，并正在连续调整。最近，与肌球蛋白颈灯链结合的自旋标记的ESR光谱精确地拟合为源自两个头部的光谱总和。还测试了其他可能性（随机 +单角），但拟合度很差。微管蛋白（TU）结合位点的侧链的自旋标记取决于驱动蛋白与Tu的饱和度，并在合作上结合。这支持了这样一个假设，即驱动蛋白的方向运动是由于TU亚基之间结合强度的空间差异引起的。