分子モーター蛋白アクチン-ミオシンのX線・ESRによる動的構造解析と結晶化

使用 X 射线和 ESR 对分子运动蛋白肌动蛋白-肌球蛋白进行动态结构分析和结晶

基本信息

批准号：
12030218
负责人：
荒田敏昭
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は筋収縮のエネルギー変換を蛋白質の分子構造に立脚して理解するために、最小単位であるアクチン単、2量、3量体とミオシン頭部の複合体のX線散乱実験とモーター蛋白用にESR精密角度計測を行った。Gアクチンを化学修飾し、全く重合しないがミオシンと結合するアクチンモノマーを調製し、ミオシン頭部S1との1:1複合体を形成させ、X線溶液散乱強度パターンのモデル計算フィットではアクチンモノマー分子上で、S1が長軸のまわりに90度以上回転した。この結果はATP加水分解中のアクチン-ミオシンの弱い結合の本体を捉えたものと考えれた。今年度はアクチン2量体、3量体を作成し、さらに高次の構造を解析した。重合しない2量体、3量体ともKl中の化学修飾で得られた。90mMKClでは2:1、3:1複合体ができた。また複合体形成によるATP分解促進やATPによる結合強度の変化も認められなかった。90mMKClにおける2:1または3:1複合体のX線散乱実験も成功し解析を始めた。その結果、アクチン単独では1、2または3量体×2を形成し、S1との結合で×2は解離し、1、2または3量体に1個のS1が結合すると解釈できた。アクチン・ミオシン複合体モノマーの結晶化も精力的に押し進めているがまだ成功には至っていない。モーター蛋白用高感度ESR測定のためループギャップ共振器を試作し、引続き調整中である。最近はミオシンネック軽鎖に結合したスピンラベルのESRスペクトルを頭部2つから由来するスペクトル和として精密fitした。それ以外の可能性(ランダム+単一角度)も検定したがフィットは悪かった。チューブリン(TU)結合部位の側鎖のスピンラベルはTUへのキネシン結合の飽和度に依存し、協同的に束縛を受けた。このことはキネシンの方向性のある運動が、TUサブユニット間で構造的に生じる結合強度の空間差によるという仮説を支持した。

为了了解基于蛋白质分子结构的肌肉收缩的能量转换，我们对肌动蛋白、二聚体和三聚体的最小单位以及肌球蛋白头的复合物进行了X射线散射实验，并使用了ESR精度。进行了角度测量。我们对G-肌动蛋白进行化学修饰，制备出完全不聚合但与肌球蛋白结合的肌动蛋白单体，并与肌球蛋白头S1形成1:1的复合物，上图中，S1绕其长轴旋转了90度以上。这一结果被认为抓住了 ATP 水解过程中弱肌动蛋白-肌球蛋白键的本质。今年，我们创建了肌动蛋白二聚体和三聚体，并分析了高阶结构。不聚合的二聚体和三聚体都是通过K1中的化学修饰获得的。在 90mM KCl 下，形成 2:1 和 3:1 复合物。此外，既没有观察到由于复合物形成而促进ATP降解，也没有观察到由于ATP而导致结合强度的变化。 90mM KCl 中 2:1 或 3:1 配合物的 X 射线散射实验也取得了成功，并且分析已经开始。结果解释为，肌动蛋白单独形成1、2或2个三聚体，并且当2与S1结合时解离，因此1个S1与1、2或三聚体结合。尽管人们正在努力结晶肌动蛋白-肌球蛋白复合物单体，但尚未取得成功。我们已经制作了用于运动蛋白高灵敏度 ESR 测量的环隙谐振器原型，并且仍在进行调整。最近，与肌球蛋白颈轻链结合的自旋标签的 ESR 光谱被精确拟合为来自两个头的光谱之和。其他可能性（随机+单角度）也进行了测试，但拟合效果较差。微管蛋白 (TU) 结合位点侧链的自旋标记根据驱动蛋白与 TU 结合的饱和度进行协同约束。这支持了这样的假设：驱动蛋白的定向运动是由于 TU 亚基之间结构上产生的键强度的空间差异造成的。