アクチン・ミオシン複合体の結晶化の試みとX線回析

尝试结晶肌动蛋白-肌球蛋白复合物和 X 射线衍射

基本信息

批准号：
06235209
负责人：
若林克三
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は筋収縮のエネルギー変換を蛋白質の分子構造に立脚して理解するために、最小単位であるアクチンとミオシン頭部の単量体コンプレックスを調製し、その結晶化とX線結晶構造解析ならびに溶液X線散乱による溶液構造解析を併用してエネルギー変換中のアクトミオシン分子の構造解明を目指した。(1)改良されたDHT/MBS-アクチンとミオシン頭部複合体の調製。すでに二価性架橋剤マレイミドベンゼン酸エステル(MBS)で難重合性アクチンとミオシン頭部との架橋複合体を形成させることに成功し、ATPによりアクチン結合部位が頭部上で1-2nm変位することを示唆する電顕観察を昨年度報告した。しかし高蛋白濃度で2:1複合体を形成し重合する欠点があった。アクチンのサブドメインIIのチロシン53をジアゾニウムテトラゾル(DHT)で化学修飾した。その結果、ファロイジンを作用させても全く重合しないアクチンモノマーが調製できた。MBS-アクチンを化学修飾してできたDHT/MBS-アクチンはDHT-アクチンより安定で、ミオシン頭部と1:1に結合した。さらにMBSによりアクチンとミオシン頭部S1との1:1架橋複合体を形成させることに成功した。この架橋複合体モノマーをカラムクロマトグラフィーにより分離精製することにも成功し、X線溶液散乱実験と結晶作成の試料とした。(2)アクチン・ミオシン頭部複合体のX線溶液散乱実験。MBS-アクチンのX線溶液散乱実験はすでに行い、分子の形態を表す慣性半径、分子コード長、分子間相互作用を示す慣性半径の濃度依存性などは未処理のG-アクチンとほぼ同じであった。しかし結晶解析されたアクチン分子とは慣性半径、コード長は少し大きかった。現在この違いが何によるのか水分子の配位、ドメイン間内部運動などモデル計算により検討している。MBS-アクチンまたはDHT/MBS-アクチンとミオシン頭部S1と1:1に混合した試料、DHT/MBS-アクチン・S1架橋複合体モノマーの試料についてX線溶液散乱実験を開始した。予備的実験によると慣性半径はS1単独に比べかなり大きいことがわかった。(3)アクチン・ミオシン頭部複合体の結晶化。DHT/MBS-アクチン・S1架橋複合体モノマーを試料として結晶化を試みている。蒸気拡散法を主に使用しマイクロプレート上でスクリーニングした。以上、現在までアクチン・ミニオン複合体モノマーの結晶化には至っていないが、これらの試料のX線溶液散乱実験はかなり進展した。現在結晶化を精力的に押し進めている。

为了根据蛋白质的分子结构了解肌肉收缩的能量转换，我们制备了肌动蛋白和肌球蛋白头（最小单位）的单体复合物，并进行了结晶、X射线晶体结构分析和溶液分析我们的目的是通过使用 X 射线散射的溶液结构分析来阐明能量转换过程中肌动球蛋白分子的结构。 (1)改进的DHT/MBS-肌动蛋白和肌球蛋白头复合物的制备。我们已经使用二价交联剂马来酰亚胺苯（MBS）成功地在难以聚合的肌动蛋白和肌球蛋白头部之间形成了交联复合物，并且肌动蛋白结合位点在头部被ATP置换了1-2 nm。去年，我们报道了表明这一点的电子显微镜观察结果。然而，它的缺点是形成 2:1 复合物并在高蛋白质浓度下聚合。肌动蛋白亚结构域 II 的酪氨酸 53 用重氮四唑 (DHT) 进行化学修饰。结果，制备出即使应用鬼笔环肽也完全不聚合的肌动蛋白单体。 DHT/MBS-actin 是通过化学修饰 MBS-actin 制成的，比 DHT-actin 更稳定，并以 1:1 的比例与肌球蛋白头部结合。此外，我们使用 MBS 成功在肌动蛋白和肌球蛋白头 S1 之间形成 1:1 交联复合物。我们还通过柱色谱法成功分离纯化了这种交联复合单体，并将其作为X射线溶液散射实验和晶体制备的样品。 (2)肌动蛋白-肌球蛋白头复合物的X射线溶液散射实验。已经对MBS-肌动蛋白进行了X射线溶液散射实验，表明分子形态的惯性半径、分子绳长度以及表明分子间相互作用的惯性半径的浓度依赖性几乎是最重要的。与未处理的 G-肌动蛋白相同。然而，惯性半径和绳索长度略大于晶体学分析的肌动蛋白分子。我们目前正在使用模型计算（例如水分子的协调和域之间的内部运动）来研究导致这种差异的原因。对以 1:1 比例与肌球蛋白头 S1 混合的 MBS-肌动蛋白或 DHT/MBS-肌动蛋白样品以及 DHT/MBS-肌动蛋白/S1 交联复合单体样品开始 X 射线溶液散射实验。初步实验表明，惯性半径明显大于单独S1的惯性半径。 (3)肌动蛋白-肌球蛋白头复合物的结晶。我们正在尝试结晶DHT/MBS-actin/S1交联复合单体作为样品。主要使用蒸气扩散法在微孔板上进行筛选。如上所述，尽管迄今尚未实现肌动蛋白-小分子复合物单体的结晶，但使用这些样品的X射线溶液散射实验已取得了相当大的进展。目前，结晶工作正在积极推进中。