培養細胞系を用いたWnt/Winglessシグナル伝達経路の生化学的解析

使用培养细胞系对 Wnt/Wingless 信号通路进行生化分析

基本信息

批准号：
11152215
负责人：
柳川伸一
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11152215/
关键词：
Wnt Wingless シグナル伝達発生

项目摘要

Dsh蛋白質はWnt/Wgシグナル並びにPlanar Polarityシグナルに関わるJNK経路を仲介する多機能のシグナルトランスデューサーで、Drosophila、マウスの多くの組織に恒常的な発現が認められる。DIX、PDZドメインがWnt/Wgシグナルに必須であり、またDEPドメインがJNKシグナルに関わる。最近生物活性を保ったWnt-3a標品が使用可能となった為、Wntシグナル伝達にともなってDvl-1,2分子が示す生化学的変化の性状を、マウスやヒトの各種培養細胞を用いて解析し、Dshファミリー蛋白質の基本的機能を同定する事を試みた。まず、1)マウスNIH3T3,L,C57MG細胞を可溶性Wnt-3a蛋白で3時間処理すると、βカテニン蛋白の著しい細胞質内蓄積が観察され、さらにそれと同時にDvl-1,2分子のSer/Thrリン酸化の亢進に伴うバンドシフトが生じた。ここに初めてDshと同様に、DvlもWnt刺激によりリン酸化を受け、活性化される可能性が示された。2)Dvl-1,2分子の動物細胞での強制発現はアポトーシスを誘導した。しかしDrosophilaのclone8翅原基細胞やSchneider S2細胞では、メタロチオネイン誘導型ベクターを用いる事によってDvl-1,2分子の誘導発現をする細胞株の樹立が可能で、強制発現させるとDrosophilaのDshの場合と同様に、Arm蛋白の蓄積ならびにDE-cadherin誘導、そして、Dvl-1,2分子の高度のSer/Thrリン酸化が生じた。Dvl-1,2蛋白はclone8細胞内の主に細胞質に斑点状に局在した。3)更にDsh,及びDvl-1,2分子には、ともに免疫共沈されてくるプロテインキナーゼが存在し、そのうちの一つはPDZドメインに結合するCasein kinase IIであった。4)さらに、Dvl-1,2蛋白の強制発現はZW3によるTauリン酸化活性を阻害する事を、リン酸化型特異的抗Tau抗体を用いたIn vivo assayによって初めて明らかにした。5)またSchneider S2細胞内でのDsh,及びDvl-1,2過剰発現によるArm蛋白の蓄積はCasein kinase Iの特異的阻害剤であるCKI-7により完全に消失した。6)現在Dvl-1,2分子の強制発現によるJNK経路の活性化機構についてリン酸化型特異的Jun抗体を用いて検討中である。

DSH蛋白是一种多功能信号TransAduber，该信号是WNT/WG信号和与平面极性信号相关的JNK路线，并且果蝇和小鼠中的许多组织都被识别。 DIX和PDZ域对于WNT/WG信号至关重要，JNK信号中的DEP域涉及。由于最近使用了生物学活性的Wnt-3a靶标，因此DVL-1和2个分子与Wnt信号一起使用的生化变化的特征用于小鼠和各种培养细胞。 DSH家族蛋白的基本功能。首先，如果将小鼠NIH3T3，L，C57MG细胞用可溶性Wnt-3A蛋白处理3小时，则观察到β-磷酸蛋白的不脱染色的固醇菌根的积累，同时DVL-1和2 Molecule ser/th由于增强而引起的磷酸化。与DSH一样，DVL首次可能是由Wnt刺激引起的，并且可以被激活。 2）在DVL-1中强迫表达，2个分子动物细胞诱导凋亡。但是，在果蝇的克隆8翼基细胞和施耐德S2细胞中，可以使用金属氨酸诱导的载体来建立诱导DVL-1和2分子的细胞储备，并在果蝇DSH中强行表达。发生DVL-1和2分子分子的de-钙粘着蛋白引导和SER/THR磷酸化。 DVL-1和2蛋白主要位于Clone8细胞中细胞质中的细胞中。 3）此外，DSH和DVL-1和2分子具有突出激酶，两者都在免疫中下沉，其中之一是酪蛋白激酶II，它与PDZ结构域结合。 4）此外，DVL-1，2蛋白的强制表达抑制了ZW3的tau磷酸化活性，并且首次揭示了使用磷酸化抗TAU抗体的体内测定。 5）此外，由于DSH和DVL-1的臂蛋白的积累，Schneider S2细胞中的2个过度表达完全被CKI-7完全消失，CKI-7是酪蛋白激酶I的特定抑制剂。 6）目前，使用磷酸化的JUN抗体正在考虑通过强制表达DVL-1和2分子激活JNK途径的机理。